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Staring2011銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
肽鏈中氨基酸的檢測
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| 請問要知道一條肽鏈兩端的氨基酸各是什么，應(yīng)該如何檢測？ |
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志子
至尊木蟲 (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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答案僅代表個人疏學(xué)，無權(quán)威性，有誤懇請指正。 1純化蛋白質(zhì)：用于序列分析的蛋白質(zhì)應(yīng)是分子大小均一，電游呈現(xiàn)一條帶具有一定純度的樣品。 2分析蛋白質(zhì)的氨基酸組成：用酸、堿等將蛋白質(zhì)肽鏈水解為游離氨基酸，再用電泳、層析等方法分離、鑒定所有游離氨基酸的種類和含量，現(xiàn)在可用氨基酸自動分析儀來快速測定。 3.測定肽鏈中N末端和C末端為何種氨基酸；若蛋白質(zhì)由兩條以上肽鏈組成，通過末端氨基酸的測定還可估計(jì)蛋白質(zhì)中的肽鏈數(shù)目。 ① N末端氨基酸測定：二硝基氟苯、丹磺酰氯都可與末端氨基反應(yīng)，再用鹽酸等將肽鏈水解，將帶有二硝基氟苯或丹磺酰氯的氨基酸水解下來，即可分離鑒定出為何種氨基酸，因丹磺酰氯具強(qiáng)烈熒光更易鑒別。 �、� C末端氨基酸測定：用相應(yīng)的羧肽酶將C末端氨基酸水解下來，因各種羧肽酸水解氨基酶的專一性不同，故可對C末端氨基酸做出鑒定。 4.將鏈間、鏈內(nèi)二硫鍵打開，否則會阻礙蛋白水解溶劑的作用，常用巰基化合物還原法。 5.選擇適當(dāng)?shù)拿富蚧瘜W(xué)試劑將肽鏈部分水解成適合作序列分析的小肽段，常用的方法有： ①胰蛋白酶法：水解賴氨酸或精氨酸的羧基形成的肽鍵，故若蛋白質(zhì)分子中有4個精氨酸或賴氨酸殘基，可得5個肽段。 ②胰凝乳蛋白酶法：水解芳香族氨基酸羧基側(cè)的肽鍵 �、垆寤璺ǎ核饧琢虬彼狒然鶄�(cè)的肽鍵。 6.測定各肽段的氨基酸排列順序： 一般采用 Edman降解法。 因 PITC(異硫氰酸苯酯)只與N末端氨基酸作用，用冷稀酸將此末端殘基水解下來，鑒定為何種氨基酸衍生物，殘留的肽段N末端可繼續(xù)與PITC反應(yīng)，依次逐個鑒定出氨基酸的排列順序。 7.多肽鏈用兩種方法分別裂解成幾組肽段，并測定每一方法中每一肽段的氨基酸排列順序，肽段重疊法確定整條肽鏈的氨基酸順序，若用兩種方法找不出重疊肽段，就需用第三種、第四種方法，直到找出重疊肽段。 8.確定二硫鍵位置： 用電泳法將拆開二硫鍵的肽段條帶與未拆開二硫鍵的條帶進(jìn)行對比即可定位二硫鍵的位置。 如此以來，一個完整蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)即可被測定 |
2樓2013-06-04 22:47:21
Staring2011
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2013-06-05 10:11:54
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