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Staring2011銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
肽鏈中氨基酸的檢測
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| 請問要知道一條肽鏈兩端的氨基酸各是什么，應(yīng)該如何檢測？ |
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志子
至尊木蟲 (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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答案僅代表個人疏學(xué)，無權(quán)威性，有誤懇請指正。 1純化蛋白質(zhì)：用于序列分析的蛋白質(zhì)應(yīng)是分子大小均一，電游呈現(xiàn)一條帶具有一定純度的樣品。 2分析蛋白質(zhì)的氨基酸組成：用酸、堿等將蛋白質(zhì)肽鏈水解為游離氨基酸，再用電泳、層析等方法分離、鑒定所有游離氨基酸的種類和含量，現(xiàn)在可用氨基酸自動分析儀來快速測定。 3.測定肽鏈中N末端和C末端為何種氨基酸；若蛋白質(zhì)由兩條以上肽鏈組成，通過末端氨基酸的測定還可估計蛋白質(zhì)中的肽鏈數(shù)目。 �、� N末端氨基酸測定：二硝基氟苯、丹磺酰氯都可與末端氨基反應(yīng)，再用鹽酸等將肽鏈水解，將帶有二硝基氟苯或丹磺酰氯的氨基酸水解下來，即可分離鑒定出為何種氨基酸，因丹磺酰氯具強烈熒光更易鑒別。 ② C末端氨基酸測定：用相應(yīng)的羧肽酶將C末端氨基酸水解下來，因各種羧肽酸水解氨基酶的專一性不同，故可對C末端氨基酸做出鑒定。 4.將鏈間、鏈內(nèi)二硫鍵打開，否則會阻礙蛋白水解溶劑的作用，常用巰基化合物還原法。 5.選擇適當(dāng)?shù)拿富蚧瘜W(xué)試劑將肽鏈部分水解成適合作序列分析的小肽段，常用的方法有： ①胰蛋白酶法：水解賴氨酸或精氨酸的羧基形成的肽鍵，故若蛋白質(zhì)分子中有4個精氨酸或賴氨酸殘基，可得5個肽段。 �、谝饶榈鞍酌阜ǎ核夥枷阕灏被狒然鶄�(cè)的肽鍵 �、垆寤璺ǎ核饧琢虬彼狒然鶄�(cè)的肽鍵。 6.測定各肽段的氨基酸排列順序： 一般采用 Edman降解法。 因 PITC(異硫氰酸苯酯)只與N末端氨基酸作用，用冷稀酸將此末端殘基水解下來，鑒定為何種氨基酸衍生物，殘留的肽段N末端可繼續(xù)與PITC反應(yīng)，依次逐個鑒定出氨基酸的排列順序。 7.多肽鏈用兩種方法分別裂解成幾組肽段，并測定每一方法中每一肽段的氨基酸排列順序，肽段重疊法確定整條肽鏈的氨基酸順序，若用兩種方法找不出重疊肽段，就需用第三種、第四種方法，直到找出重疊肽段。 8.確定二硫鍵位置： 用電泳法將拆開二硫鍵的肽段條帶與未拆開二硫鍵的條帶進行對比即可定位二硫鍵的位置。 如此以來，一個完整蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)即可被測定 |
2樓2013-06-04 22:47:21
Staring2011
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2013-06-05 10:11:54
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