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water9yoyo銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
目的片段與載體連接不上，化轉(zhuǎn)和電轉(zhuǎn)后在紅霉素的板兒上不長
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| 我的目的片段大小2600，濃度大概有22ng/ul;酶切后載體大小有2700，濃度大概有63ng/ul,10ul的連接體系為solutionI 5，目的片段4，載體1，之前也做過各種片段與載體比例的梯度，用質(zhì)粒的鑒定引物P連接體系，能P出目的條帶，但是做化轉(zhuǎn)不長菌，也做了電轉(zhuǎn)（電壓1800/1200/1000/800,1mm電轉(zhuǎn)杯）脈沖時(shí)間均在5ms以上，也是不長，感受態(tài)都驗(yàn)證過了，效率很高，電轉(zhuǎn)及化轉(zhuǎn)都是進(jìn)入大腸，涂的板兒的抗性是紅霉素180ug/ul,長的很慢，將近3天，出來的也是假陽性或是不長，之前實(shí)驗(yàn)室的師姐用的是100ug/ul,我用就長菌膜，找到原因是抗性失效，然后重新配抗性倒的180ug/ul,求各位大神幫忙找一下問題所在，本人懷疑是連接體系的問題，所用的酶切位點(diǎn)是Pst1和sal1,做了將近1個(gè)月的連接，還是沒連上，我都絕望了，還有試過將目的片段連T載，發(fā)現(xiàn)連不上，原因不明 |
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酶切專家
金蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
water9yoyo: 金幣+1, ★有幫助, 提供了一個(gè)克隆技巧 2013-06-16 11:06:42
kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-06-16 16:00:11
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| 如果你確定你的克隆技術(shù)本身沒問題（關(guān)于克隆的具體技巧，可以參見http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html），那么可能是該基因?qū)λ拗骷?xì)胞有很強(qiáng)的毒性，這在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常能碰到。 |
2樓2013-06-14 22:23:43
water9yoyo
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2013-06-16 11:05:38
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