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憨憨可愛(ài)多木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
AFLP預(yù)擴(kuò)增沒(méi)有條帶 已有1人參與
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酶切連接完跑膠條帶不是很亮，而且預(yù)擴(kuò)跑完膠什么都沒(méi)有，是什么問(wèn)題？ 步驟跟用量如下： 1.3.1 限制性酶切及連接 在0.5ml離心管中加入（20 ul） 對(duì)照 樣品 對(duì)照模板DNA 4（50ng/ul） DNA模板(濃度:1ul電泳可見(jiàn)即可,或50ng/ul) 4ul adapter 1ul 1ul EcoR I/Mse I 2ul 2ul 10XReaction buffer 2.5ul 2.5ul 10mM ATP 2.5ul 2.5ul T4 Ligase 1ul 1ul AFLP-Water 7ul 7ul 混勻離心數(shù)秒 37℃保溫5小時(shí) ,8℃保溫4小時(shí)，4℃過(guò)夜。 1.3.2 預(yù)擴(kuò)增反映 在0.5ml或0.2ml離心管中按下列方式加入：體積（25 ul） 模板DNA 2ul Pre-ampmix 1ul dNTP 0.5ul 10×PCR buffer 2.5ul Taq DNA polymerase 0.5ul AFLP-Water 18.5ul 離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 ① 預(yù)變性 94℃ 2min ② 94℃ 30S，56℃ 30S，72℃ 80S（循環(huán)30輪） ③ 延伸加時(shí)72℃ 5min 1.3.3 選擇性PCR擴(kuò)增 ⑴ 需選擇引物對(duì)。（） ⑵ 用AFLP-TE將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物按1:20稀釋?zhuān)鳛檫x擴(kuò)模板。 ⑶ 在0.5ml或0.2ml離心管中，按下列方式加入：體積(20ul體系) 預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品 2ul 10×PCR buffer 2.5ul dNTP 0.5ul EcoRI 引物 1ul（共8種，） MseI 引物 1ul（共2種，） Taq 酶 0.5ul AFLP-Water 17.5ul 以上混勻，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)PCR循環(huán)。 ① 預(yù)變性 94℃ 2min ② 第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃ 30S， 65℃ 30S，72℃ 80S ③ 以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7或1℃，擴(kuò)增14或10輪。 注：遞減0.7℃，則擴(kuò)增14輪，遞減1℃則擴(kuò)增10輪。 ④ 接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪 94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 80S ⑤ 延伸加時(shí) 72℃ 5min |
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2樓2013-06-27 16:01:37
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