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leor銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
如何研究小分子抑制蛋白降解途徑？
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最近研究一個(gè)小分子化合物抑制蛋白降解方面的課題。研究發(fā)現(xiàn)該小分子化合物能夠促進(jìn)某個(gè)蛋白的表達(dá)，但是對(duì)轉(zhuǎn)錄水平未見(jiàn)有影響，因此，考慮其在蛋白降解方面發(fā)揮作用，打算從泛素化和自噬途徑考察該小分子化合物對(duì)蛋白降解的作用。 現(xiàn)有疑問(wèn)是，分別用這倆條途徑的抑制劑研究蛋白降解了還是用激動(dòng)劑了？ 謝謝！ |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-17 23:05:55
leor: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝你寶貴的意見(jiàn)！ 2013-06-18 22:22:14
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我沒(méi)有完全理解你的意思。我大致的理解是你想設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定一個(gè)小分子化合物抑制蛋白降解的作用發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平還是發(fā)生在翻譯后水平。我理解的對(duì)嗎？ 如果我的理解沒(méi)有錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪且沂荆耗硞�(gè)小分子與某特定蛋白質(zhì)的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平的特定蛋白質(zhì)（比如轉(zhuǎn)錄因子，但是不限于轉(zhuǎn)錄因子）相互作用，還是與參與蛋白質(zhì)酶水解的蛋白質(zhì)相互作用？或者該小分子在前兩者中都起了作用？ 那么實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵是：利用Protein-ligand interaction的方法確定目的小分子直接與哪些蛋白質(zhì)發(fā)生了直接的相互作用，然后用與小分子發(fā)生了直接的相互作用的蛋白質(zhì)，再通過(guò)Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction的實(shí)驗(yàn)方法一步一步向下調(diào)取出能夠明確地確定某個(gè)作用末端的蛋白質(zhì)到底是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控蛋白質(zhì)還是參與蛋白質(zhì)酶水解的蛋白質(zhì)，總之末端作用的蛋白質(zhì)必須是生物功能已知且明確的。這樣實(shí)驗(yàn)就成功了。 Protein-ligand interaction，Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction，都有許多成熟的方法（下面我會(huì)給出文獻(xiàn)），不過(guò)我建議還是在活細(xì)胞內(nèi)觀測(cè)Protein-ligand interaction，Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction比較直接，勞動(dòng)量也低，效率高；但是體外實(shí)驗(yàn)也必須進(jìn)行，兩者相互配合試驗(yàn)進(jìn)度很快。 我建議使用熒光顯微鏡，用有機(jī)分子染料標(biāo)記所研究的小分子，待其起作用后用特定波長(zhǎng)的熒光照射細(xì)胞，大致確定熒光所在的位置；然后對(duì)同一批樣品可以再用電子顯微鏡觀測(cè)有機(jī)分子染料標(biāo)記所研究的小分子的鄰近區(qū)域有沒(méi)有在轉(zhuǎn)錄的DNA，如果有的話，就優(yōu)先考慮有機(jī)分子染料標(biāo)記所研究的小分子可能是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)揮了作用，沒(méi)有也不一定就能否定，只是不優(yōu)先考慮有機(jī)分子染料標(biāo)記所研究的小分子可能是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)揮了作用，但是不能否定這樣的可能性；如果可能的話，可以短時(shí)間內(nèi)完全阻斷目的蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程但是不阻礙翻譯，檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的原有含量是否明顯變化；在體外用Pull-down、NMR、阻滯電泳、紅外光譜、熒光光譜、電子顯微鏡觀測(cè)、能量轉(zhuǎn)移等生物物理學(xué)試驗(yàn)方法檢測(cè)確定機(jī)分子染料標(biāo)記所研究的小分子可能相互作用的蛋白質(zhì)，酵母雙雜交和噬菌體展示就算了（你要是不累，可以嘗試酵母雙雜交和噬菌體展示  ）；根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以對(duì)可能的所研究的小分子作用的蛋白質(zhì)加以有機(jī)染料分子標(biāo)記（不同的蛋白質(zhì)可以做不同的顏色的有機(jī)染料分子標(biāo)記），然后用熒光顯微鏡觀測(cè)小分子的熒光與哪種熒光據(jù)合在一起。所有用熒光標(biāo)記的大分子都可以用量子點(diǎn)標(biāo)記。（僅供參考！可繼續(xù)討論） |
2樓2013-06-17 22:54:44
凌波麗
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-17 23:06:05
kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-17 23:06:05
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我剛剛想到的更簡(jiǎn)單的辦法。你可以將表達(dá)的可能的被過(guò)表達(dá)或者被抑制降解的蛋白質(zhì)的基因用無(wú)細(xì)胞的體外表達(dá)體系研究，這時(shí)就沒(méi)有了降解方面的干擾；然后再在無(wú)細(xì)胞體系中加入有關(guān)的降解該蛋白質(zhì)的蛋白酶的基因，或者特定蛋白酶成品，看看兩者加入和不加入所要研究的小分子使得可能的被過(guò)表達(dá)或者被抑制降解的蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。 如果沒(méi)有無(wú)細(xì)胞的體外表達(dá)體系，就把將表達(dá)的可能的被過(guò)表達(dá)或者被抑制降解的蛋白質(zhì)的基因克隆到原核的不表達(dá)特定蛋白酶的工程細(xì)胞中；將降解該蛋白質(zhì)的蛋白酶的基因也克隆進(jìn)去到前一種工程細(xì)胞中，看看兩者加入和不加入所要研究的小分子使得可能的被過(guò)表達(dá)或者被抑制降解的蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。 意見(jiàn)僅供參考！可以繼續(xù)討論. |
3樓2013-06-17 23:05:11
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-06-18 12:16:11
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MMB 528-Membrane Proteomics,305-protein-ligand interaction，F(xiàn)ree http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=5997732 |
4樓2013-06-18 00:29:54
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5樓2013-06-20 11:44:38
沙門小rna
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6樓2013-11-05 13:03:24
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