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leor銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
如何研究小分子抑制蛋白降解途徑？
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最近研究一個小分子化合物抑制蛋白降解方面的課題。研究發(fā)現(xiàn)該小分子化合物能夠促進某個蛋白的表達，但是對轉(zhuǎn)錄水平未見有影響，因此，考慮其在蛋白降解方面發(fā)揮作用，打算從泛素化和自噬途徑考察該小分子化合物對蛋白降解的作用。 現(xiàn)有疑問是，分別用這倆條途徑的抑制劑研究蛋白降解了還是用激動劑了？ 謝謝！ |
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 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 | 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 | 細胞生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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凌波麗
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leor: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝你寶貴的意見！ 2013-06-18 22:22:14
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我沒有完全理解你的意思。我大致的理解是你想設(shè)計實驗來確定一個小分子化合物抑制蛋白降解的作用發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平還是發(fā)生在翻譯后水平。我理解的對嗎？ 如果我的理解沒有錯誤，實驗?zāi)康木褪且沂荆耗硞�小分子與某特定蛋白質(zhì)的表達的轉(zhuǎn)錄水平的特定蛋白質(zhì)（比如轉(zhuǎn)錄因子，但是不限于轉(zhuǎn)錄因子）相互作用，還是與參與蛋白質(zhì)酶水解的蛋白質(zhì)相互作用？或者該小分子在前兩者中都起了作用？ 那么實驗研究的關(guān)鍵是：利用Protein-ligand interaction的方法確定目的小分子直接與哪些蛋白質(zhì)發(fā)生了直接的相互作用，然后用與小分子發(fā)生了直接的相互作用的蛋白質(zhì)，再通過Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction的實驗方法一步一步向下調(diào)取出能夠明確地確定某個作用末端的蛋白質(zhì)到底是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控蛋白質(zhì)還是參與蛋白質(zhì)酶水解的蛋白質(zhì)，總之末端作用的蛋白質(zhì)必須是生物功能已知且明確的。這樣實驗就成功了。 Protein-ligand interaction，Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction，都有許多成熟的方法（下面我會給出文獻），不過我建議還是在活細胞內(nèi)觀測Protein-ligand interaction，Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction比較直接，勞動量也低，效率高；但是體外實驗也必須進行，兩者相互配合試驗進度很快。 我建議使用熒光顯微鏡，用有機分子染料標記所研究的小分子，待其起作用后用特定波長的熒光照射細胞，大致確定熒光所在的位置；然后對同一批樣品可以再用電子顯微鏡觀測有機分子染料標記所研究的小分子的鄰近區(qū)域有沒有在轉(zhuǎn)錄的DNA，如果有的話，就優(yōu)先考慮有機分子染料標記所研究的小分子可能是在轉(zhuǎn)錄過程發(fā)揮了作用，沒有也不一定就能否定，只是不優(yōu)先考慮有機分子染料標記所研究的小分子可能是在轉(zhuǎn)錄過程發(fā)揮了作用，但是不能否定這樣的可能性；如果可能的話，可以短時間內(nèi)完全阻斷目的蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄過程但是不阻礙翻譯，檢測目的蛋白質(zhì)的原有含量是否明顯變化；在體外用Pull-down、NMR、阻滯電泳、紅外光譜、熒光光譜、電子顯微鏡觀測、能量轉(zhuǎn)移等生物物理學(xué)試驗方法檢測確定機分子染料標記所研究的小分子可能相互作用的蛋白質(zhì)，酵母雙雜交和噬菌體展示就算了（你要是不累，可以嘗試酵母雙雜交和噬菌體展示  ）；根據(jù)體外實驗的結(jié)果可以對可能的所研究的小分子作用的蛋白質(zhì)加以有機染料分子標記（不同的蛋白質(zhì)可以做不同的顏色的有機染料分子標記），然后用熒光顯微鏡觀測小分子的熒光與哪種熒光據(jù)合在一起。所有用熒光標記的大分子都可以用量子點標記。（僅供參考！可繼續(xù)討論） |
2樓2013-06-17 22:54:44
凌波麗
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我剛剛想到的更簡單的辦法。你可以將表達的可能的被過表達或者被抑制降解的蛋白質(zhì)的基因用無細胞的體外表達體系研究，這時就沒有了降解方面的干擾；然后再在無細胞體系中加入有關(guān)的降解該蛋白質(zhì)的蛋白酶的基因，或者特定蛋白酶成品，看看兩者加入和不加入所要研究的小分子使得可能的被過表達或者被抑制降解的蛋白質(zhì)表達量的變化。 如果沒有無細胞的體外表達體系，就把將表達的可能的被過表達或者被抑制降解的蛋白質(zhì)的基因克隆到原核的不表達特定蛋白酶的工程細胞中；將降解該蛋白質(zhì)的蛋白酶的基因也克隆進去到前一種工程細胞中，看看兩者加入和不加入所要研究的小分子使得可能的被過表達或者被抑制降解的蛋白質(zhì)表達量的變化。 意見僅供參考！可以繼續(xù)討論. |
3樓2013-06-17 23:05:11
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MMB 528-Membrane Proteomics,305-protein-ligand interaction，F(xiàn)ree http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=5997732 |
4樓2013-06-18 00:29:54
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