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質(zhì)粒的線性化與轉(zhuǎn)染效率 已有2人參與
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質(zhì)粒DNA經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，僅有一部分被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)通�？梢栽�1－4天內(nèi)可以檢測(cè)到。一周后，由于大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋，因此，也就檢測(cè)不到其存在了。 轉(zhuǎn)染可以分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（transient transfection）指的是轉(zhuǎn)染的核酸不整合到染色體上，結(jié)果是短暫的高水平表達(dá)，可在24—96小時(shí)內(nèi)檢測(cè)表達(dá)效果，表達(dá)水平與位置無關(guān)，不會(huì)受到周圍染色體元件的影響。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定轉(zhuǎn)染少，但因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大，不長久也不穩(wěn)定。超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更傾向于瞬時(shí)表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)適合研究啟動(dòng)子等調(diào)控元件。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染指的是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上，或者相當(dāng)于附加子（episome）可持續(xù)存在，使得轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可長期表達(dá)。外源基因整合的幾率很小，要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通常需要有篩選標(biāo)記（比如抗性基因）共同轉(zhuǎn)染，通過選擇壓力維持表達(dá)的穩(wěn)定，不能通過的就被干掉了。質(zhì)粒整合到染色體上本來就是件稀罕事兒，平均萬分之一的幾率，如果是線性化DNA轉(zhuǎn)染，那整合的幾率就高多了。不過再怎么整合也就是一個(gè)或者有限的幾個(gè)拷貝，所以表達(dá)量往往不會(huì)太高。但是，“壓倒一切的是'穩(wěn)定'”，很多時(shí)候，轉(zhuǎn)染后往往要進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)的篩選。例如，常用G418進(jìn)行篩選，用以獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。 |
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