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細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒復(fù)制
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大家好！ 我有個問題 最近在做細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用的是293細(xì)胞和pcDNA3.1質(zhì)粒。 我想問的是，質(zhì)粒會在細(xì)胞中復(fù)制么？ 如果質(zhì)粒在細(xì)胞中復(fù)制，為什么又要篩選做穩(wěn)定株？ |
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心的斑斑 2013-03-13 16:31:57
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心的斑斑 2013-03-13 16:31:57
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293細(xì)胞系是原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化細(xì)胞，表達轉(zhuǎn)染的腺病毒5的基因。 293T細(xì)胞表達 E1A蛋白和SV40大T抗原，因此含有SV40復(fù)制起始點與啟動子區(qū)的質(zhì)�？梢栽谄渲袕�(fù)制。 你最近在做細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用的是293細(xì)胞和pcDNA3.1質(zhì)粒，因為293細(xì)胞不含有SV40大T抗原，因此即使pcDNA3.1質(zhì)粒含有SV40 ori，pcDNA3.1也不能在293細(xì)胞中復(fù)制，如果你轉(zhuǎn)染的是293T細(xì)胞，那么pcDNA3.1 就可在其中復(fù)制了。 至于為什么又要篩選做穩(wěn)定株，是因為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進293細(xì)胞作為episome的形式存在，不能復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂，質(zhì)粒會被隨機分配到其兩子代細(xì)胞中發(fā)生稀釋至最終丟失。而篩選出來的穩(wěn)定株，此時的質(zhì)粒已經(jīng)被整合進宿主染色體，隨著宿主基因組DNA的復(fù)制而一起復(fù)制，并穩(wěn)定遺傳給子代。 |
9樓2013-03-13 15:00:13
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23樓2014-10-29 08:50:13
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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| 其實這個問題歸根結(jié)底就是：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的區(qū)別，瞬時轉(zhuǎn)染的目的是得到少量的一些蛋白實驗一下，如果蛋白可用而且需要大量生產(chǎn)的話，就要進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，只要篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，直接培養(yǎng)這個細(xì)胞株就可以方便容易的得到大量的蛋白，因為瞬轉(zhuǎn)不能滿足大量生產(chǎn)的需求，培養(yǎng)1L細(xì)胞需要1mg質(zhì)粒只能得到1mg蛋白，如果需要1g 2g甚至更大量的蛋白，那要多少質(zhì)粒才能滿足需求，那樣光合成質(zhì)粒就要花幾百萬，所以只能篩選穩(wěn)定細(xì)胞株才能解決這個問題，如果知道瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)的原理也就明白這個意思了，瞬時轉(zhuǎn)染表達質(zhì)�；蚪M不整合到細(xì)胞自身基因組上隨著細(xì)胞的生長分裂3-4天質(zhì)�；蚓蜁䜩G失，這時候收集細(xì)胞，只能得到很少量的質(zhì)粒表達的蛋白，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是吧外源基因直接整合到細(xì)胞基因組上，經(jīng)過一系列的抗性篩選最終得到能夠穩(wěn)定表達的細(xì)胞株，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
24樓2015-10-29 15:00:54
簡單回復(fù)
yingying158810樓
2013-03-13 19:55
wsmcc(金幣+1): 謝謝參與
haixiawu13樓
2013-03-19 05:53
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