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細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒復(fù)制
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大家好！ 我有個(gè)問(wèn)題 最近在做細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用的是293細(xì)胞和pcDNA3.1質(zhì)粒。 我想問(wèn)的是，質(zhì)粒會(huì)在細(xì)胞中復(fù)制么？ 如果質(zhì)粒在細(xì)胞中復(fù)制，為什么又要篩選做穩(wěn)定株？ |
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心的斑斑 2013-03-13 16:31:57
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心的斑斑 2013-03-13 16:31:57
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293細(xì)胞系是原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化細(xì)胞，表達(dá)轉(zhuǎn)染的腺病毒5的基因。 293T細(xì)胞表達(dá) E1A蛋白和SV40大T抗原，因此含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒可以在其中復(fù)制。 你最近在做細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用的是293細(xì)胞和pcDNA3.1質(zhì)粒，因?yàn)?93細(xì)胞不含有SV40大T抗原，因此即使pcDNA3.1質(zhì)粒含有SV40 ori，pcDNA3.1也不能在293細(xì)胞中復(fù)制，如果你轉(zhuǎn)染的是293T細(xì)胞，那么pcDNA3.1 就可在其中復(fù)制了。 至于為什么又要篩選做穩(wěn)定株，是因?yàn)橘|(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞作為episome的形式存在，不能復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂，質(zhì)粒會(huì)被隨機(jī)分配到其兩子代細(xì)胞中發(fā)生稀釋至最終丟失。而篩選出來(lái)的穩(wěn)定株，此時(shí)的質(zhì)粒已經(jīng)被整合進(jìn)宿主染色體，隨著宿主基因組DNA的復(fù)制而一起復(fù)制，并穩(wěn)定遺傳給子代。 |
9樓2013-03-13 15:00:13
userhung
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
| 其實(shí)這個(gè)問(wèn)題歸根結(jié)底就是：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的區(qū)別，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的目的是得到少量的一些蛋白實(shí)驗(yàn)一下，如果蛋白可用而且需要大量生產(chǎn)的話，就要進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，只要篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，直接培養(yǎng)這個(gè)細(xì)胞株就可以方便容易的得到大量的蛋白，因?yàn)樗厕D(zhuǎn)不能滿足大量生產(chǎn)的需求，培養(yǎng)1L細(xì)胞需要1mg質(zhì)粒只能得到1mg蛋白，如果需要1g 2g甚至更大量的蛋白，那要多少質(zhì)粒才能滿足需求，那樣光合成質(zhì)粒就要花幾百萬(wàn)，所以只能篩選穩(wěn)定細(xì)胞株才能解決這個(gè)問(wèn)題，如果知道瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)的原理也就明白這個(gè)意思了，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)�；蚪M不整合到細(xì)胞自身基因組上隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂3-4天質(zhì)�；蚓蜁�(huì)丟失，這時(shí)候收集細(xì)胞，只能得到很少量的質(zhì)粒表達(dá)的蛋白，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是吧外源基因直接整合到細(xì)胞基因組上，經(jīng)過(guò)一系列的抗性篩選最終得到能夠穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
24樓2015-10-29 15:00:54
簡(jiǎn)單回復(fù)
yingying158810樓
2013-03-13 19:55
wsmcc(金幣+1): 謝謝參與
haixiawu13樓
2013-03-19 05:53
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