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風(fēng)中的羽翼_銅蟲 (小有名氣)
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RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)問題-----傳代、凍存和復(fù)蘇 已有1人參與
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RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)總遇到問題。 這個細(xì)胞我是從別人那里要的。 第一次要來之后，凍存了一批，在-80℃中可以復(fù)蘇成功，于是把種子細(xì)胞扔掉了，并且把凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮。后來藥品到了，復(fù)蘇細(xì)胞做實驗時，卻怎么都不能成功。 第二次厚著臉皮跟別人又要來一次，回來了大量擴(kuò)增凍存，轉(zhuǎn)入液氮。這次留了一個心眼，種子細(xì)胞沒有丟掉。但是現(xiàn)在轉(zhuǎn)入液氮的細(xì)胞怎么都不能復(fù)蘇成功，種子細(xì)胞已經(jīng)傳到10次以上，生長速度變得很慢，狀態(tài)倒是還可以。 有沒有在培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞方面很有經(jīng)驗的前輩給我傳授下經(jīng)驗？？本人萬分感謝。 我的傳代方法：棄去舊培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)液，用移液器反復(fù)吹打，然后一分為二轉(zhuǎn)至兩個新平皿，每皿補(bǔ)足5ml的培養(yǎng)體積。 我的凍存方法： 凍存液是血清：DMSO=9:1。凍存采用 4℃20min, -20℃20min,-80℃過夜，然后轉(zhuǎn)入液氮。 我的復(fù)蘇方法：從液氮中取出凍存的細(xì)胞，37-39℃下快速融化凍存的細(xì)胞液，用PBS緩沖液1500rpm離心3min，棄上清，用5ml培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀吹勻。 每次從液氮中復(fù)蘇的細(xì)胞都死掉，幾乎不能存活。但是之前有一次從-80℃中卻可以成功復(fù)蘇�，F(xiàn)在等著用它來多肽對內(nèi)毒素的抑制活性，愁死了。 希望好心人幫一下。 |
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 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) | 分子細(xì)胞生物學(xué)實驗 |
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vivien520584
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【答案】應(yīng)助回帖
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風(fēng)中的羽翼_: 金幣+1 2013-10-18 10:39:54
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我之前也養(yǎng)過Raw264.7的細(xì)胞，凍存和復(fù)蘇的方法和你都有點不同 凍存時凍存液為50%血清，10%DMSO，40%培養(yǎng)基，放入凍存盒后4℃30min，直接轉(zhuǎn)入-80℃，過夜后轉(zhuǎn)入液氮。 復(fù)蘇時 將液氮中細(xì)胞直接放入37℃左右水浴中快速解凍，后加入5倍體積培養(yǎng)基，800rpm離心3min，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 成功率基本上99.9%，沒什么問題。 |
6樓2013-10-18 09:58:40
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