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nnxqwei至尊木蟲 (職業(yè)作家)
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[求助]
求助酶的Kcat 計算！
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求助Kcat 計算！ 我用終濃度為100nM 純酶（分子量440ＫDa）對一類底物進行動力學(xué)測定，比活力為68Ｕ/mg, 通過雙曲線法得到底物的km值為0.2 mM, Vmax為40.22 mM/min，我用常用的公式計算酶對該底物的Kcat＝Vmax/[Ｅ]，結(jié)果好象不對�。�！搞了好長時間，越來越糊涂了，請高手支招呀，謝謝！Kcat 應(yīng)該得多少呢，應(yīng)該如何計算呢？ [ Last edited by nnxqwei on 2013-7-3 at 15:30 ] |
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137167741: 金幣+2, 小木蟲交流，共同進步~~ 2013-07-06 14:00:12
nnxqwei: 金幣+10, ★★★很有幫助 2013-07-23 21:06:15
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以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖最常用，測定和計算簡便，也比較準確。 將米-曼氏方程進行倒數(shù)處理，得下列方程： 以1/V0為縱坐標，1/[S]為橫坐標作圖可得一直線。縱軸截距為1/Vmax，斜率為Km/Vmax，橫軸截距為-1/Km。舉例 1/V = 240.5 + 577.2 x 1/[S] ， Vmax is 1/240.5 = 0.00416 ， Km = 0.00416 x 577.2 = 2.40 。 ” 100nM 純酶（分子量440ＫDa）對一類底物進行動力學(xué)測定，比活力為68Ｕ/mg “，100nM*440000 (ng/L)=44000 000/1000 000 (mg/L)=44 （mg/L） ，計算得酶濃度時44mg/L 。 68U/mg*44mg/L=2992U/L=2.992u/ml ，計算得到比酶活是2.992u/ml，約3u/ml。不知道酶活是如何定義的，如果提供的信息、數(shù)據(jù)更多，更好確定。 |
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nnxqwei5樓2013-07-06 11:55:06
nnxqwei
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【答案】應(yīng)助回帖
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nnxqwei: 金幣+10, ★★★很有幫助, 很有參考意義! 2013-09-21 16:37:42
nnxqwei: 金幣+10, ★★★很有幫助, 很有參考意義! 2013-09-21 16:37:42
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Kcat是用Vmax算出來的，而Vmax顯然是外推得到的。而米氏方程完成的條件是在測定過程中底物濃度變化不大，在底物濃度太低時，由于底物的量少，變化率可能較大加上系統(tǒng)的波動（導(dǎo)致不準）而底物濃度太高，速度太快，導(dǎo)致初速度測不準。這樣就使得有效數(shù)據(jù)受兩端數(shù)據(jù)影響很大。所以有時推出的Vmax顯得匪夷所思，其實是很正常的。 樓主的計算沒有問題，不過0.1uM的酶濃度可能偏高，估計測得的Vmax可能偏低。。kcat可以用s-1表示422200/60=7036.666667s-1。kcat/Km=3,5183,333.33M-1* S-1.應(yīng)該在合理范圍。 |
8樓2013-09-13 11:13:17
9樓2015-09-09 22:03:10
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