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[求助]
不同剪切體的鑒定？
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| 本人，在克隆一個(gè)基因的cDNA的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)這個(gè)基因的剪切體，現(xiàn)在得到這兩個(gè)不同剪切體的序列。其中都是內(nèi)含子滯留，現(xiàn)在對(duì)這兩個(gè)序列進(jìn)行分析.用NCBI，ORF Finder尋找ORF，發(fā)現(xiàn)ORF斷斷續(xù)續(xù)的，而且ORF都比較短。現(xiàn)在不知道如何分析這兩個(gè)序列是否編碼蛋白質(zhì)。另外求助有關(guān)于不同剪切體如何翻譯到蛋白質(zhì)的。 |
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嗯，你說(shuō)的情況是有的，可能存在DNA的污染，我設(shè)計(jì)的引物是根據(jù)基因cDNA序列，擴(kuò)增CDS，掐頭去尾，現(xiàn)在得到的序列他的情況是，缺失不同外顯子和內(nèi)含子滯留，通過(guò)同NCBI的est比對(duì)，也比對(duì)到這些結(jié)果。這些也是DNA污染的結(jié)果？如果DNA污染的話，應(yīng)該是所有內(nèi)含子都應(yīng)該擴(kuò)增出來(lái)，現(xiàn)在只擴(kuò)增出一些內(nèi)含子，不是全部，請(qǐng)問(wèn)，我現(xiàn)在該怎么做？ 從新再反轉(zhuǎn)錄，然后再鑒定這些剪切體嗎？ |
3樓2013-08-03 16:18:40
lmcyjxs
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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cnb1987(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-07-06 17:20:36
gyesang: MolEPI+1, 很好！ 2013-08-04 00:44:39
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gyesang: MolEPI+1, 很好！ 2013-08-04 00:44:39
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如果你是用RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后擴(kuò)增還得到帶內(nèi)含子的序列，那么建議你做兩點(diǎn)試試：1 設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物重新從擴(kuò)增；2 RNA中可能有DNA污染，建議用DNA消化酶消化一下，再反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，或者用一些本身有DNAase I試劑的RT-PCR試劑盒，在反轉(zhuǎn)錄時(shí)直接加入，方便、簡(jiǎn)單、快捷。因?yàn)橥闳NA時(shí)，對(duì)你的樣品又是一損失，可咨詢下寶生物的技術(shù)人員，那里有相關(guān)的試劑盒。 估計(jì)你擴(kuò)增得到的序列比你用來(lái)設(shè)計(jì)引物的模版序列長(zhǎng)吧？當(dāng)你去掉內(nèi)含子后，或許你會(huì)發(fā)現(xiàn)，匹配度很高。含有內(nèi)含子，往往就會(huì)出現(xiàn)有TGA等終止密碼子，因此，你分析的ORF是斷續(xù)的。 如果你的剪切體是包含有完整的CDS，那么當(dāng)你的剪切體去掉內(nèi)含子后，把它翻譯成蛋白，直接在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)里去比對(duì)，你可以大致知道蛋白的功能。 |
2樓2013-07-06 15:41:02
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