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章信來(lái)木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
可變剪切體RT-PCR檢測(cè)的技術(shù)問(wèn)題
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各位蟲(chóng)友： 我有個(gè)基因存在不止一種類型可變剪切情況，當(dāng)共同點(diǎn)是基因中間片段缺失，我想設(shè)計(jì)兩端保守位的引物，采用RT-PCR的方法檢測(cè)不同組織間的分布規(guī)律，如果都存在的話會(huì)同時(shí)擴(kuò)增出幾條大小不等的目的條帶，RT-PCR結(jié)果則完全不是那么回事，所有組織只能擴(kuò)增出一條最小的可變剪切體，其他的，尤其是未發(fā)生可變剪切的原始基因都擴(kuò)增不出來(lái)，請(qǐng)各位蟲(chóng)友幫忙分析下原因和解決辦法（PCR條件優(yōu)化很多次了，不見(jiàn)任何改觀），謝謝各位！ |
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2樓2013-04-02 16:19:22
3樓2013-04-02 21:11:06
章信來(lái)
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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4樓2013-04-03 19:19:38
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5樓2013-04-03 19:27:12
6樓2013-07-05 09:45:59
章信來(lái)
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7樓2013-07-06 22:15:59
【答案】應(yīng)助回帖
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第一、你怎么知道是不止一種可變剪切體 第二、即使存在不止一種的可變剪切體，它們?cè)诓煌M織的表達(dá)量高低如何，如果其他的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于你那個(gè)所謂的最短的“可變剪切形式”（準(zhǔn)確地說(shuō)應(yīng)該叫做：剪切形式），那么其他剪切形式是不會(huì)在你RT-PCR的過(guò)程中出現(xiàn)，至少幾率很小。 第三、即使出現(xiàn)，也會(huì)由于產(chǎn)量太小而不會(huì)觀察到。 第四、要確定是何種剪切方式，可與基因組DNA比較。是內(nèi)含子保留，還是5’剪切，3‘剪切等等’ 第五、在獲得可變剪切體后，可以構(gòu)建表達(dá)載體，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。 第六、構(gòu)建真核表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，是該基因過(guò)表達(dá)，檢測(cè)該基因所在信號(hào)通路上下游基因表達(dá)量差異，確定那種剪切體是其主要作用的。 實(shí)驗(yàn)順利~~~ |
8樓2013-07-07 08:34:52
aiguoss0902
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9樓2015-01-27 09:29:52
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