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關(guān)于RT-PCR中逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的問(wèn)題！
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| 各位做過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的高手們，本人在2012年6月20日購(gòu)買到RT試劑盒，到現(xiàn)在快有5個(gè)月了，8月份才開始使用。在8月份的時(shí)候做RT-PCR目的基因可以擴(kuò)增出來(lái)，等到9月中旬的時(shí)候，一直擴(kuò)增不出目的條帶，檢測(cè)RNAOD比值2.01，電泳效果完整性也比較好，5s不太亮。我想問(wèn)一下各位，有沒(méi)有可能是試劑盒中的逆轉(zhuǎn)錄酶的活力下降了，反復(fù)凍融后活力下降了？我買了后沒(méi)有分裝逆轉(zhuǎn)錄酶，只是用的時(shí)候從-20度取出來(lái)，放在冰盒上操作，再放回-20度。前后如此操作差不多有20次。原因是不是8月份的時(shí)候是夏天，氣溫挺高的（四大火爐之一），酶拿出來(lái)后溫差太大，這樣子，反復(fù)凍融操作出現(xiàn)活力下降了！？？ 請(qǐng)分析一下原因，謝謝了！ |
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2樓2012-10-15 09:15:19
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-15 13:53:06
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| 你的酶都是在冰上操作的話問(wèn)題應(yīng)該不大。在-20度的時(shí)候酶的stock里有甘油，也不會(huì)凍上的，所以不存在凍融問(wèn)題。只要你做的時(shí)候才把酶拿出冰箱，在冰盒上取用后迅速放回冰箱就可以了。你所謂的P不出來(lái)是指反轉(zhuǎn)后的cDNA為模板，P不出目的基因還是P什么都沒(méi)有呢？比如說(shuō)內(nèi)參什么的？還有就是你提的RNA是不是立即做了反轉(zhuǎn)錄，有沒(méi)有反復(fù)凍融？你做的是什么物種，一般mRNA的半壽期是多少？ |
3樓2012-10-15 09:26:25
cicelyzh
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4樓2012-10-15 09:28:31
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p不出來(lái)指反轉(zhuǎn)后的cDNA為模板，P不出目的基因。當(dāng)加入的酶的量是1ul的時(shí)候，內(nèi)參都沒(méi)有，當(dāng)加入3ul的時(shí)候，才可以看見(jiàn)內(nèi)參。我做的人晶狀體上皮細(xì)胞。我所提取的RNA是立即進(jìn)行了RT-PCR，沒(méi)有反復(fù)凍融！ 一般mRNA的半壽期我們好像沒(méi)有關(guān)注這個(gè)問(wèn)題��！ 我所用的試劑盒中有兩種逆轉(zhuǎn)錄的方法，有一種需要進(jìn)行65度5min的RNA變性，主要是破除mRNA的復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，但是我沒(méi)有采用這種方法，我擔(dān)心會(huì)有RNA的降解，就采取了另一種，不用65度5min的變性處理。不知道這個(gè)會(huì)不會(huì)產(chǎn)生什么影響！ |
5樓2012-10-15 11:02:53
cicelyzh
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)積極交流問(wèn)題 2012-10-17 14:48:48
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)積極交流問(wèn)題 2012-10-17 14:48:48
| 有可能是RNA降解了，理論上RNA和cDNA放-80冰箱沒(méi)問(wèn)題，但是我發(fā)現(xiàn)放置不能超過(guò)一個(gè)月。RNA，跑電泳看不出啥，實(shí)際上還是降解的；最好做個(gè)逆轉(zhuǎn)錄，cDNA跑電泳檢測(cè)完整性。總之，酶沒(méi)有問(wèn)題，是RNA的問(wèn)題。幫同學(xué)做過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，由于RNA樣品是溶解在乙醇中寄過(guò)來(lái)的，第一次，沒(méi)有及時(shí)處理，放了一個(gè)月，RT-PCR不成功；第二次寄過(guò)來(lái)，及時(shí)處理并逆轉(zhuǎn)錄，目的基因就被擴(kuò)出來(lái)了。 |
9樓2012-10-16 18:20:17
10樓2012-10-16 18:52:28
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