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[求助]
關于RT-PCR中逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的問題！
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| 各位做過逆轉(zhuǎn)錄的高手們，本人在2012年6月20日購買到RT試劑盒，到現(xiàn)在快有5個月了，8月份才開始使用。在8月份的時候做RT-PCR目的基因可以擴增出來，等到9月中旬的時候，一直擴增不出目的條帶，檢測RNAOD比值2.01，電泳效果完整性也比較好，5s不太亮。我想問一下各位，有沒有可能是試劑盒中的逆轉(zhuǎn)錄酶的活力下降了，反復凍融后活力下降了？我買了后沒有分裝逆轉(zhuǎn)錄酶，只是用的時候從-20度取出來，放在冰盒上操作，再放回-20度。前后如此操作差不多有20次。原因是不是8月份的時候是夏天，氣溫挺高的（四大火爐之一），酶拿出來后溫差太大，這樣子，反復凍融操作出現(xiàn)活力下降了��？？ 請分析一下原因，謝謝了！ |
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tulip1213
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵積極交流問題 2012-10-17 14:48:48
感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵積極交流問題 2012-10-17 14:48:48
| 有可能是RNA降解了，理論上RNA和cDNA放-80冰箱沒問題，但是我發(fā)現(xiàn)放置不能超過一個月。RNA，跑電泳看不出啥，實際上還是降解的；最好做個逆轉(zhuǎn)錄，cDNA跑電泳檢測完整性。總之，酶沒有問題，是RNA的問題。幫同學做過逆轉(zhuǎn)錄，由于RNA樣品是溶解在乙醇中寄過來的，第一次，沒有及時處理，放了一個月，RT-PCR不成功；第二次寄過來，及時處理并逆轉(zhuǎn)錄，目的基因就被擴出來了。 |
9樓2012-10-16 18:20:17
2樓2012-10-15 09:15:19
cicelyzh
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3樓2012-10-15 09:26:25
cicelyzh
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4樓2012-10-15 09:28:31
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