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[求助]
關(guān)于基因克隆的一些實驗技術(shù)問題
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| 小弟基因克隆新手，用的是限制性內(nèi)切酶和連接，目前遇到兩個問題，一個是用內(nèi)切酶HindIII 和EcoRI 對有目的基因的質(zhì)粒和PCDNA3.1酶切后，回收膠的回收率特別低，切完后看到的條帶還很亮，回收后再電泳就很弱，測濃度發(fā)現(xiàn)只有10ng/ul左右，用的是QIAGEN的QIAEX II 試劑盒，小弟自己分析的原因是，50°水浴之后EP管里液體的顏色不夠黃，也就是PH太高，沒有調(diào)PH，還有一個就是在最后加水溶解DNA的時候水的PH偏酸，沒有調(diào)到8.0。第二個問題是酶切的體系問題，含有目的基因的質(zhì)粒酶切體系是10ul的Tvector，HindIII 和EcoRI各3ul，buffer4ul,共40ul體系，不知道PCDNA應(yīng)該用什么樣的體系，切多少，好像說連接的時候靶基因?qū)|(zhì)粒的摩爾數(shù)之比要在5-9:1，對這個概念我不是太懂。Tvector濃度是5.6ug/ul，純化后的PCDNA濃度是0.86ug/ul。 |
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gyesang
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6樓2013-07-13 15:58:39
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1. 產(chǎn)物回收后，不用測濃度，到時候連接時，往體系里面多加點片段 2. 你的酶切體系有問題，EcoRI和HindIII酶根本不用這么多 質(zhì)粒 1ug EcoRI 1ul HindIII 1ul Buffer 2ul ----------------------------- 補齊水到20ul 目的基因的T載體，可以多切些，但1ug也足夠了 載體一定要少切，一般400ng足夠了，20ul體系，要充分保證載體被酶切開 |
2樓2013-07-13 15:27:08
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4樓2013-07-13 15:35:57
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