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關(guān)于western相關(guān)試劑材料的選擇（轉(zhuǎn)） 已有7人參與
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1、樣品的制備：仍然是選擇RIPA裂解液和PMSF作為黃金搭檔，經(jīng)費充足的實驗室考慮特異性的蛋白酶抑制劑cocktail，磷酸酶抑制劑就不需要特別添加了，因為RIPA裂解液里面一般都含有NaF，我覺得應(yīng)該足夠了。因為碧云天里面的蛋白裂解液比較便宜，很多客戶會選擇這個公司的產(chǎn)品，在這當(dāng)中有些客戶唯恐提的蛋白有大的損失，喜歡用強的RIPA裂解液，覺得裂解的越徹底越好，結(jié)果得到的裂解產(chǎn)物里面有很多膠凍樣的粘稠物，這些東西可能是細(xì)胞核里面DNA，有時候離心都難離下來，特別是提細(xì)胞全蛋白的時候，在此希望客戶按部就班的選擇合適的裂解液，不是越強越好。如果檢測的目的蛋白不是部分或者全部位于細(xì)胞核內(nèi)，我一般不建議用這種強的RIPA裂解液。另外，檢測特異部位蛋白的表達(dá)情況，比如線粒體，細(xì)胞核，細(xì)胞膜等部位，要根據(jù)實際情況選擇合適的提取試劑盒，我看國內(nèi)有好多公司都會提供相應(yīng)的試劑盒，上海生工，南京凱基，碧云天都有，和國外pierce這些廠家的提取試劑盒相比，效果怎么樣，我沒有比較過，就不發(fā)表評論。順便提一下，這樣部位內(nèi)參的選擇，經(jīng)費充足的實驗室，可以選擇特異的內(nèi)參，比如組蛋白作為核蛋白內(nèi)參，離子通道蛋白作為膜內(nèi)參。當(dāng)然，用胞漿蛋白GAPDH或者beta-actin，作為內(nèi)參，我個人覺得也沒有大問題，解釋呢是提取的蛋白過程中會有固定比例的胞漿蛋白的污染。另外，選擇進(jìn)口膜蛋白提取試劑盒，一定要慎重，仔細(xì)看一下說明書再確定是否購買，現(xiàn)在國外膜蛋白提取試劑盒得到大家公認(rèn)的是sigma，merck和piece公司，但是前面兩個對離心的條件非常苛刻，大部分實驗室達(dá)不到這個條件，而pierce的要求則不那么苛刻。 2、蛋白的定量：這一步也是非常重要的，作為后面加樣，確定每孔加樣體積的參考依據(jù)很重要。很多教科書都寫一孔加30-100ug就可以了。每孔也不是加的蛋白量越大越好。蛋白定量試劑盒，用國產(chǎn)的就可以了，上海生工，碧云天，上海博彩的都還不錯。 3、蛋白上樣緩沖液：不管是2*的還是5*的，不管是自己配的還是從公司購買的，都差不多，因為配方上沒有什么大的差別，足量的溴酚藍(lán)，還原劑beta-巰基乙醇，帶動蛋白下沉的甘油等等。這里有個問題，客戶經(jīng)常問我，我也不知道答案。提好的蛋白定完量后，和上樣緩沖液一起煮過再保存，是不是更好？ 4、SDS-PAGE配膠系列：sigma和bio-rad，都有，東西很好，但是我這邊的客戶很少會選擇這兩個廠家，因為價格太貴，而且分裝的配膠相關(guān)的試劑或者碧云天的配膠試劑盒，做出來的蛋白電泳圖片，也是非常漂亮的，No problem。甘氨酸、tris-堿，SDS這些對試劑的級別要求不是很高，選擇分裝的，ok。 5、蛋白marker：對于，western blot檢測來說，一般會選擇彩虹蛋白marker或者發(fā)光marker，這兩種marker各有優(yōu)勢。彩虹蛋白marker，可以幫助判斷電泳時間是否到位，轉(zhuǎn)膜是否成功以及準(zhǔn)確的裁膜，這對一次電泳同時檢測幾個指標(biāo)非常重要。在這里不得不提到Fermentas的經(jīng)典之作，SM0671，10-170kd，覺得非常經(jīng)典，指示的非常清楚，這個品牌旗下其他貨號的彩虹marker和它比，都很遜色。發(fā)光蛋白marker則可以準(zhǔn)確的在膠片上顯示目的條帶的大概分子量，在發(fā)表的文章上面顯示出來，個人感覺增色不少。在蛋白marker的選擇上，存在著一個誤區(qū)，好多客戶總是非常挑剔的去選擇具有和自己檢測的目的蛋白最相近的條帶的marker，其實在western bolt檢測中，我覺得一點必要沒有。western blot檢測過程中抗體結(jié)合的特異性決定了檢測的特異性，以及抗體說明書里面的對目的條帶位置的描述用到的“approximately”這個字眼，就絕對marker只起到大體的參考作用就可以了。 6、轉(zhuǎn)膜過程中濾紙和膜的選擇：濾紙就選擇whatman 的3M濾紙。膜到底選擇Nc膜還是PVDF膜，就和選擇蘿卜還是白菜一樣，看個人的喜好了，雖然資料里面寫的是PVDF膜對蛋白具有更強的結(jié)合力。對于小分子的蛋白的檢測，推薦選擇0.22um 孔徑的膜，另外及時調(diào)整轉(zhuǎn)膜電壓和時間，防止蛋白穿透。 7、封閉：脫脂奶粉（國產(chǎn)的光明牌據(jù)說還不錯）還是粗制的BSA，都可以。如果后面檢測發(fā)現(xiàn)背景很深，其他抗體濃度等條件也調(diào)整過后，還是不見效的的情況下，就可以選擇另外一種封閉條件試試看。 8、一抗：western blot檢測中最燒錢的一抗閃亮登場了，這個話題永遠(yuǎn)都是討論的最多的。下面這幾個廠家的抗體還是我比較喜歡并樂意推薦給客戶的，CST，Millipore旗下的chemicon產(chǎn)品，RnD，Abcam，Sigma，epitomics，santa cruz的都還可以。這里簡單的提到兩個公司的產(chǎn)品，CST和santa cruz，其余的有空再長長的寫一篇。CST抗體，質(zhì)量好，性價比高，信號通路方面比較全，而且抗體效價比較穩(wěn)定，一般1：1000稀釋去做，不需要怎么去摸條件，缺點是抗體的種類大部分集中在信號通路方面，相對來說品種少了，另外一個不得不說的就是CST抗體的投訴率雖然比較低，但是投訴成功率也不高，這樣讓我們中間的試劑商很難做，聽說吉泰從去年因為這個原因退出了對CST的代理。Santa cruz的抗體，的確投訴率很高，現(xiàn)在在客戶當(dāng)中的口碑也不怎么好，那些因為從其他幾個大公司買不到自己所需的抗體的客戶，不得不選擇santa cruz抗體做實驗的客戶，往往帶著有色眼鏡去對待它，很多時候不愿意花多的精力去優(yōu)化條件。但是santa的抗體，也有優(yōu)點，品種全，售后服務(wù)好，權(quán)威文獻(xiàn)里面應(yīng)用的也很多，投訴成功率還是比較高的，呵呵。內(nèi)參抗體的選擇，有錢的客戶可以選擇進(jìn)口的大品牌，經(jīng)費緊張的選擇杭州賢至，杭州華安的也不錯。上面廢話太多了，下面簡單點。 9、抗體稀釋液：碧云天的就可以，實用。 10、HRP標(biāo)記的二抗：國產(chǎn)的足夠。不放心的話，可以用國內(nèi)試劑商分裝的jackson二抗，真的還不錯，效價高，價格低。 11、ECL：推薦pierce的貨號34079，34080。Thermo pierce前兩年，推出來的專門針對中國客戶的super ECl，價格的確便宜了很多，但是和pierce原裝的比，真的不是一個檔次，表現(xiàn)為淬滅的非�？臁２豢蜌獾恼f，比較坑人。12、膠片：柯達(dá)和富士的都可以。 13、顯影定影粉：天津產(chǎn)的就可以。 |
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