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atlanticwi金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
關(guān)于使載體平末端環(huán)化的問(wèn)題
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嗯...............好久木有冒泡，決定核潛艇上浮一番~ 剛好實(shí)驗(yàn)也有點(diǎn)問(wèn)題，想求助各位 具體情況如下： 需要構(gòu)建一個(gè)新載體，想法是從現(xiàn)有載體上直接去除一部分序列就會(huì)成為我要的載體，所以采用PCR的方法，反向擴(kuò)增了這個(gè)載體我需要的部分，然后用激酶處理這個(gè)線性片段后，想用連接酶環(huán)化此片段。 問(wèn)題出現(xiàn)在： 需要的載體片段約有11kb左右，環(huán)化線性片段會(huì)非常困難，我試過(guò)幾次均未成功，看有些資料顯示，越長(zhǎng)的片段可能形成多聚體的概率會(huì)越大。 想問(wèn)一下是否能有什么添加劑或者方法之類的，促進(jìn)長(zhǎng)片段DNA的自我環(huán)化連接呢？ 盼高手出現(xiàn)，給予指點(diǎn)�；虼蠹壹紡V益，共同探討，共同進(jìn)步~ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-07-31 14:08:00
atlanticwi: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝 gibson assembly應(yīng)該是個(gè)好辦法 2013-08-02 12:26:06
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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atlanticwi: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝 gibson assembly應(yīng)該是個(gè)好辦法 2013-08-02 12:26:06
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如果一定要這么做，可以嘗試2000000U/ml的T4ligase或者Blunt/TA Ligase Master Mix之類的。 其實(shí)為啥不設(shè)計(jì)一段overlap呢，然后直接轉(zhuǎn)就行了（就如同定點(diǎn)突變）。 如果BsaI或者同類酶對(duì)你的質(zhì)粒適用，也可以用這種酶切連接完成（產(chǎn)物是沒(méi)有酶切位點(diǎn)的） |
2樓2013-07-31 12:20:20
Haibara_Ai
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3樓2013-07-31 12:26:04
atlanticwi
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4樓2013-07-31 13:20:31
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6樓2013-07-31 20:41:27
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-07-31 22:21:06
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| 直接PCR環(huán)化確實(shí)有點(diǎn)難，你首先需要確定你PCR產(chǎn)物確實(shí)是平末端，因?yàn)楹芏郥aq具有末端家A功能，如果確實(shí)是平末端的話，用平末端連接酶進(jìn)行環(huán)化應(yīng)該沒(méi)多大問(wèn)題，注意體系中PCR產(chǎn)物濃度，不要過(guò)多。其實(shí)最好的方法就是在正、反向引物上設(shè)計(jì)同一個(gè)酶切位點(diǎn)，然后，酶切，連接就好，設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的時(shí)候注意方向問(wèn)題！Good luck！ |
7樓2013-07-31 21:18:24
gyesang
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8樓2013-07-31 22:23:58
atlanticwi
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嗯........ 問(wèn)題就出在這里，我需要的是去除載體的一段序列，但是不能加入任何一個(gè)堿基，因?yàn)檫@個(gè)構(gòu)建好的載體要去做BiFC，加入堿基肯定會(huì)有影響。否則的話我是絕對(duì)不想玩平端自連的。 問(wèn)題肯定不是構(gòu)建策略上的，因?yàn)檫@樣做是我們唯一的辦法。是否能夠環(huán)化我認(rèn)為才是這個(gè)實(shí)驗(yàn)中最麻煩的一步。 PCR產(chǎn)物的磷酸化這個(gè)成功與否也比較難以判斷。我個(gè)人認(rèn)為即使成功了如此高bp數(shù)的DNA還是很難環(huán)化自連接的，因?yàn)閎p數(shù)越大，是傾向于分子間連接的...................... 所以呢...........So麻煩呢................... |
9樓2013-07-31 23:03:56
gyesang
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10樓2013-08-01 00:36:58
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