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atlanticwi金蟲 (正式寫手)
琴美喜歡發(fā)呆 不喜歡發(fā)脾氣
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[求助]
關(guān)于使載體平末端環(huán)化的問題
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嗯...............好久木有冒泡，決定核潛艇上浮一番~ 剛好實(shí)驗(yàn)也有點(diǎn)問題，想求助各位 具體情況如下： 需要構(gòu)建一個(gè)新載體，想法是從現(xiàn)有載體上直接去除一部分序列就會(huì)成為我要的載體，所以采用PCR的方法，反向擴(kuò)增了這個(gè)載體我需要的部分，然后用激酶處理這個(gè)線性片段后，想用連接酶環(huán)化此片段。 問題出現(xiàn)在： 需要的載體片段約有11kb左右，環(huán)化線性片段會(huì)非常困難，我試過幾次均未成功，看有些資料顯示，越長的片段可能形成多聚體的概率會(huì)越大。 想問一下是否能有什么添加劑或者方法之類的，促進(jìn)長片段DNA的自我環(huán)化連接呢？ 盼高手出現(xiàn)，給予指點(diǎn)�；虼蠹壹紡V益，共同探討，共同進(jìn)步~ |
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atlanticwi
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嗯........ 問題就出在這里，我需要的是去除載體的一段序列，但是不能加入任何一個(gè)堿基，因?yàn)檫@個(gè)構(gòu)建好的載體要去做BiFC，加入堿基肯定會(huì)有影響。否則的話我是絕對不想玩平端自連的。 問題肯定不是構(gòu)建策略上的，因?yàn)檫@樣做是我們唯一的辦法。是否能夠環(huán)化我認(rèn)為才是這個(gè)實(shí)驗(yàn)中最麻煩的一步。 PCR產(chǎn)物的磷酸化這個(gè)成功與否也比較難以判斷。我個(gè)人認(rèn)為即使成功了如此高bp數(shù)的DNA還是很難環(huán)化自連接的，因?yàn)閎p數(shù)越大，是傾向于分子間連接的...................... 所以呢...........So麻煩呢................... |
9樓2013-07-31 23:03:56
Haibara_Ai
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如果一定要這么做，可以嘗試2000000U/ml的T4ligase或者Blunt/TA Ligase Master Mix之類的。 其實(shí)為啥不設(shè)計(jì)一段overlap呢，然后直接轉(zhuǎn)就行了（就如同定點(diǎn)突變）。 如果BsaI或者同類酶對你的質(zhì)粒適用，也可以用這種酶切連接完成（產(chǎn)物是沒有酶切位點(diǎn)的） |
2樓2013-07-31 12:20:20
Haibara_Ai
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3樓2013-07-31 12:26:04
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4樓2013-07-31 13:20:31
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