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SOD、POD、CAT、LOX酶活性的測(cè)定方法 已有1人參與
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| SOD、POD、CAT、LOX酶活性的測(cè)定方法 |
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 酶測(cè)定 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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一、超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定（氮藍(lán)四唑光化還原法） 1、試劑的配制 （1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。 分別用蒸餾水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。 （2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。 （4）60μM核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。 （5）2.25mM 氮藍(lán)四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制備：取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入2ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清液即為酶液。 2、酶活性測(cè)定 （1）反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn))：分別取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸緩沖液5.4ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻； （2）分別取3ml反應(yīng)混合液和30μl酶液于試管中 （3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應(yīng)20min； 同時(shí)做兩支對(duì)照管，其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后測(cè)定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測(cè)定時(shí)用于調(diào)零。 （4）以不照光的對(duì)照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測(cè)OD560(出現(xiàn)顏色即可測(cè)定)。 （5）酶活性計(jì)算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50％所需酶量（測(cè)的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個(gè)酶活單位（u）。 SOD總活性＝ /（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD總活性/蛋白質(zhì)含量 SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積)；Vt為測(cè)定時(shí)的酶液用量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g，測(cè)定時(shí)應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。 二、POD、CAT酶活性的測(cè)定 粗酶液制備同SOD。 1、過氧化物酶（POD）活性測(cè)定（愈創(chuàng)木酚法） （1）試劑配制： 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：分別取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混勻即為1000ml PBS(0.2M，pH6.0)； （2）反應(yīng)混合液配制（以60個(gè)樣為準(zhǔn)）： 取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml 30％的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。 （3）樣品測(cè)定： 取3ml反應(yīng)液并加入30μl酶液，以PBS為對(duì)照調(diào)零，而后測(cè)定OD470值（測(cè)定40秒）。（邊加樣邊測(cè)定，測(cè)定前等待5秒，動(dòng)作要快，如果慢的話，要保證每個(gè)樣品從加好樣到開始記時(shí)的時(shí)間相差不大）每30S讀數(shù)一次。 （4）酶活性計(jì)算：以每min OD值變化（升高）0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。 POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA470：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml，(1.6ml）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ml，30ul）。 2、過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定 （1）試劑配制： 0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。 （2）反應(yīng)液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）搖勻即可。 （3）樣品測(cè)定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液，以PBS為對(duì)照調(diào)零，測(cè)定OD240（紫外）（測(cè)定40s）。 （4）酶活性計(jì)算：以每min OD值減少0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。 CAT=/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA240：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml， 1.6ml）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ml, 0.1ml）。 此類方法，許多實(shí)驗(yàn)書上都有，藥典上也有。 |
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晨間霧都2樓2013-08-05 16:04:45
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