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senlinpeiyu銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
植物山茶過氧化氫酶（CAT）活性測定問題 已有2人參與
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1、過氧化氫酶（CAT）活性測定 （1）試劑配制： A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。 分別用蒸餾水定容到1000ml。 0.15mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。 （2）反應(yīng)液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）搖勻即可。 （3）酶液制備：取0.1g（因?yàn)槿~片非常少，取了0.1g的樣）葉片，洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清液即為酶液。酶液提取出來后，當(dāng)天沒有測定，于是把酶液保存在4度冰箱里面。 （4）樣品測定：取3ml反應(yīng)液加入50ul 山茶酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定OD240（紫外）（測定40s）。 （5）酶活性計(jì)算：以每min OD值減少0.01為1個酶活性單位（u）。 CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA240：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml， 1.6ml）；Vs為測定時取用酶液體積（ml, 0.1ml）。 用紫外可見分光光度計(jì)，石英比色皿，測定的時候用緩沖液做空白調(diào)零。然后測的時候，先加反應(yīng)液3ml，再加酶液0.1ml，搖勻。然后計(jì)時，測定吸光度的減小情況。本來測定的數(shù)據(jù)應(yīng)該是減小的，0s時吸光度最大，40s時吸光度最小，呈下降趨勢。但結(jié)果我測出來數(shù)據(jù)一直增大，這是為什么呢？是藥品的問題，還是這個方法不適合測定山茶的過氧化氫酶的活性，還是其他的問題。 請大俠賜教�。�！非常非常感謝�。�！ [ Last edited by senlinpeiyu on 2013-1-23 at 16:55 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
senlinpeiyu: 金幣+1, ★有幫助, 我又磨了一批樣，離心出來了，又測定了一次，還是不可以，步驟還是同樣的步驟。 2013-01-23 19:08:58
xy656691: 金幣+2, 感謝積極應(yīng)助 2013-01-23 19:50:02
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xy656691: 金幣+2, 感謝積極應(yīng)助 2013-01-23 19:50:02
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我以前也是用這種方法測CAT，該方法用于山茶應(yīng)該也沒有問題。你可以試試如下幾條： 1 反應(yīng)液檢測前現(xiàn)用現(xiàn)配，加大H2O2用量試試（H2O2一般不會有什么問題，我以前都是放4度冰箱保存，但為了保險(xiǎn)起見，重新買一瓶用吧） 2 加大樣品用量，試試100 或200微升 3 你手頭有沒有商品過氧化氫酶，配一點(diǎn)過氧化氫酶溶液，用你的方法測一下，看吸光度如何變化。 |
2樓2013-01-23 17:32:25
xy656691
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6樓2013-01-25 21:55:45
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1.可以買過氧化氫酶，配一點(diǎn)過氧化氫酶溶液，用你的方法測一下，看吸光度如何變化。一直想這樣做但沒有時間。 2.比色是一定要用石英比色皿。 3.可以嘗試把H2O2稀釋，在測定。如果不行，可以用下面的方法。 4.過氧化氫酶的活性測定——高錳酸鉀滴定法 【原理】 過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。 R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－) R(Fe+3OH－)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2 據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 【儀器和用具】 研缽；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒溫水��；容量瓶25ml×1。 【試劑】 10% H2SO4；0.2mol/L磷酸緩沖液pH7.8； 0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定； 0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大約等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定； 0.1mol/L草酸：稱取優(yōu)級純H2C2O4 •2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。 【方法】 1.酶液提取 取小麥葉片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。 2.取50ml三角瓶4個（兩個測定兩個對照），測定瓶中加入酶液2.5ml，對照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時計(jì)時，于30℃恒溫水浴中保溫10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。 3.用0.1mol/L KMnＯ4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。 4.結(jié)果計(jì)算： 酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示： 酶活(mgH2O2/gFW•min)= 式中 A—對照KMnO4滴定毫升數(shù)； B—酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT—酶液總量（ml）； V1—反應(yīng)所用酶液量（ml）; W—樣品鮮重（g）； 1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mg H2O2。 【注意】 所用KMnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經(jīng)過重新標(biāo)定 |
10樓2013-04-10 09:29:01
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