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senlinpeiyu銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
植物山茶過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定問(wèn)題 已有2人參與
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1、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定 （1）試劑配制： A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。 分別用蒸餾水定容到1000ml。 0.15mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。 （2）反應(yīng)液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）搖勻即可。 （3）酶液制備：取0.1g（因?yàn)槿~片非常少，取了0.1g的樣）葉片，洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清液即為酶液。酶液提取出來(lái)后，當(dāng)天沒(méi)有測(cè)定，于是把酶液保存在4度冰箱里面。 （4）樣品測(cè)定：取3ml反應(yīng)液加入50ul 山茶酶液，以PBS為對(duì)照調(diào)零，測(cè)定OD240（紫外）（測(cè)定40s）。 （5）酶活性計(jì)算：以每min OD值減少0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。 CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA240：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml， 1.6ml）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ml, 0.1ml）。 用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，石英比色皿，測(cè)定的時(shí)候用緩沖液做空白調(diào)零。然后測(cè)的時(shí)候，先加反應(yīng)液3ml，再加酶液0.1ml，搖勻。然后計(jì)時(shí)，測(cè)定吸光度的減小情況。本來(lái)測(cè)定的數(shù)據(jù)應(yīng)該是減小的，0s時(shí)吸光度最大，40s時(shí)吸光度最小，呈下降趨勢(shì)。但結(jié)果我測(cè)出來(lái)數(shù)據(jù)一直增大，這是為什么呢？是藥品的問(wèn)題，還是這個(gè)方法不適合測(cè)定山茶的過(guò)氧化氫酶的活性，還是其他的問(wèn)題。 請(qǐng)大俠賜教�。�！非常非常感謝！��！ [ Last edited by senlinpeiyu on 2013-1-23 at 16:55 ] |
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starseacow
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7樓2013-01-25 22:24:11
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senlinpeiyu: 金幣+1, ★有幫助, 我又磨了一批樣，離心出來(lái)了，又測(cè)定了一次，還是不可以，步驟還是同樣的步驟。 2013-01-23 19:08:58
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xy656691: 金幣+2, 感謝積極應(yīng)助 2013-01-23 19:50:02
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我以前也是用這種方法測(cè)CAT，該方法用于山茶應(yīng)該也沒(méi)有問(wèn)題。你可以試試如下幾條： 1 反應(yīng)液檢測(cè)前現(xiàn)用現(xiàn)配，加大H2O2用量試試（H2O2一般不會(huì)有什么問(wèn)題，我以前都是放4度冰箱保存，但為了保險(xiǎn)起見(jiàn)，重新買一瓶用吧） 2 加大樣品用量，試試100 或200微升 3 你手頭有沒(méi)有商品過(guò)氧化氫酶，配一點(diǎn)過(guò)氧化氫酶溶液，用你的方法測(cè)一下，看吸光度如何變化。 |
2樓2013-01-23 17:32:25
xy656691
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3樓2013-01-24 20:56:54
senlinpeiyu
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4樓2013-01-25 21:52:47
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