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123彭好好

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[求助] 蛋白質(zhì)SDS-丙烯酰胺凝膠電泳連mark都沒有跑動(dòng)

我利用不同的溶液提取了蛋清中的幾種不同溶性的蛋白質(zhì)，進(jìn)行了兩次電泳，全都失敗了。所有的點(diǎn)樣及mark都沒有動(dòng)，在63V電壓下跑了2個(gè)多小時(shí)。樣品沒有經(jīng)過透析處理，就直接和樣品緩沖液混合煮沸了5分鐘，就開始點(diǎn)樣了。不知道具體的問題出在哪里，讓我的實(shí)驗(yàn)沒有辦法正常進(jìn)行，希望能有人幫我解答！！
以下是我所用的膠的配方：
10%分離膠：
水                                  1.9ml
1.5mol/l Tris-Hcl(PH=8.8) 1ml
30%丙烯酰胺                   1.7ml
10%SDS                         50μl
10%AP                            50μl
TEMED                            2μL

濃縮膠：
水                                  1.4ml
1.5mol/l Tris-Hcl(PH=6.8) 0.25ml
30%丙烯酰胺                   0.33ml
10%SDS                         20μl
10%AP                            20μl
TEMED                            2μL

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1樓 2013-08-16 08:59:16

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windygo

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123彭好好: 金幣+1, ★有幫助 2013-08-20 17:58:59

樓主別著急，先看是否你的電泳槽正負(fù)極接反了；
如果都好著的話，那就看下自己的其他東西有沒有配錯(cuò)，比如說電極緩沖液等。

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我已經(jīng)開始懷念那些人，那些事了~

2樓2013-08-16 09:48:13

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2樓: Originally posted by windygo at 2013-08-16 09:48:13
樓主別著急，先看是否你的電泳槽正負(fù)極接反了；
如果都好著的話，那就看下自己的其他東西有沒有配錯(cuò)，比如說電極緩沖液等。

電極是沒有接反的，我用的電極緩沖配方是：
Tris             3.02g
甘氨酸       14.4g
SDS             1g
水                1L
我覺得問題應(yīng)該不出在這里吧？

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3樓2013-08-16 12:03:56

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sunnymen

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hsd3521: 應(yīng)助指數(shù)-1, 非有效應(yīng)助 2013-08-17 10:20:50

63V電壓，怎么選擇這個(gè)電壓，奇怪

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4樓2013-08-16 16:31:11

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sunnymen

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hsd3521: 屏蔽內(nèi)容, 不支持QQ群宣傳 2013-08-17 10:21:08

本帖內(nèi)容被屏蔽

5樓2013-08-16 16:33:22

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hujiasong

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【答案】應(yīng)助回帖

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123彭好好: 金幣+3, ★★★很有幫助 2013-08-20 17:57:59

我不知道你用的是哪一本書的參考做的，我們用的是下面那本書做的。

你這個(gè)問題我們實(shí)驗(yàn)室也遇到了，查水、電壓、電流等問題都不行，最后檢測出來是分離膠的濃度不對，讓很多樣品一直都在濃縮膠里面跑，根本沒法在分離膠里分開。你下去仔細(xì)查下你的分離膠份的配比，我看了下和我們經(jīng)常做出來的比例都不一樣，你下去好好看下，因?yàn)橐灿泻芏鄥⒖紩旧砭褪清e(cuò)誤的，尤其是那些參考文獻(xiàn)的。

配分離膠的比例

參考書

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6樓2013-08-16 16:58:07

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6樓: Originally posted by hujiasong at 2013-08-16 16:58:07
我不知道你用的是哪一本書的參考做的，我們用的是下面那本書做的。

你這個(gè)問題我們實(shí)驗(yàn)室也遇到了，查水、電壓、電流等問題都不行，最后檢測出來是分離膠的濃度不對，讓很多樣品一直都在濃縮膠里面跑，根本沒 ...

我將膠的配方改了一下
10%分離膠：
水                                  2.6ml
3mol/l Tris-Hcl(PH=8.8)       0.6ml
30%丙烯酰胺                   1.7ml
10%SDS                         50μl
10%AP                            50μl
TEMED                            5μL

濃縮膠：
水                                  0.7ml
1.5mol/l Tris-Hcl(PH=6.8)    0.75ml
30%丙烯酰胺                   1.5ml
10%SDS                         30μl
10%AP                            30μl
TEMED                            4μL
但是還沒有開始跑膠，不知道結(jié)果會(huì)怎樣

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7樓2013-08-16 17:50:43

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引用回帖:

7樓: Originally posted by 123彭好好 at 2013-08-16 17:50:43
我將膠的配方改了一下
10%分離膠：
水                                  2.6ml
3mol/l Tris-Hcl(PH=8.8)       0.6ml
30%丙烯酰胺                   1.7ml
10%SDS                         50μl
...

實(shí)驗(yàn)是做出來的。你先按照你的參考去做下看看結(jié)果。一個(gè)電泳也就一天的時(shí)間，只是麻煩你再重新配下你的分離膠了。記住SDS和丙烯酰胺的比例要對，不然maker出不來，一定要找個(gè)很正規(guī)的參考書來配。

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8樓2013-08-16 18:01:47

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首先，如果電源接反了，溴酚藍(lán)會(huì)從上面溢出，電極緩沖液會(huì)變成藍(lán)色；
第二，在電泳過程中溴酚藍(lán)的指示作用比較重要，如果有電流通過的話，溴酚藍(lán)會(huì)隨著電流向下跑的，如果溴酚藍(lán)沒有動(dòng)，說明膠片中都沒通電，根據(jù)這個(gè)你可以找下原因，沒有PAGE膠片無法做進(jìn)一步分析！

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人生的三大悲�。翰恢肋x擇，不堅(jiān)持選擇，不斷選擇！

9樓2013-08-16 18:43:33

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hsd3521: 應(yīng)助指數(shù)+1 2013-08-17 10:21:54

好好檢查各溶液的配置，還有，溶液配好后，有沒有存放在4攝氏度條件下，這個(gè)本就是很多細(xì)節(jié)問題，樓主好運(yùn)。

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10樓2013-08-17 08:54:43

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