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什么實驗可以驗證一個蛋白對dna的nicking作用
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jiangcheng14(kx444555代發(fā)): 金幣+20, 鼓勵交流 2013-09-20 20:21:26
jiangcheng14: 金幣+80 2013-10-29 15:58:40
jiangcheng14(kx444555代發(fā)): 金幣+20, 鼓勵交流 2013-09-20 20:21:26
jiangcheng14: 金幣+80 2013-10-29 15:58:40
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如果某種蛋白質(zhì)與DNA片段相互作用并可能參與DNA的單鏈修復(fù)，你可以分幾步來做(我盡量選擇技術(shù)和設(shè)備要求低的實驗方案，各部分的序號不是隨機排列，代表了實驗的流程順序）： 確定這一蛋白質(zhì)的相對分子量，用質(zhì)譜很容易測定，用SDS-PAGE電泳也可以。想必在分離提純時已經(jīng)獲得了目的蛋白質(zhì)的相對分子量。 確定目的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，可以用胰蛋白酶對其有限水解，然后分別對水解片段用質(zhì)譜測定相對分子量，然后到蛋白質(zhì)組的有關(guān)數(shù)據(jù)庫中搜索出對應(yīng)的蛋白質(zhì)，以此獲得目的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息和基因的編碼信息，如果幸運的話，還可以獲得目的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的信息；如果在蛋白質(zhì)組的有關(guān)數(shù)據(jù)庫中搜索不到對應(yīng)的蛋白質(zhì)，那么說明這是一個全新的蛋白質(zhì)，必須對其進行從頭測序，用全自動測序儀即可，可以本實驗室測定，也可以送交有條件的生物技術(shù)公司，確定目的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)已經(jīng)信息提交國際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。無論如何，確定目的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)都是發(fā)表論文所必需的。 確定目的蛋白質(zhì)的細胞定位，方法很多，下面說三種方法為例。 （1）以共表達的目的蛋白質(zhì)-熒光蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)確定目的蛋白質(zhì)的細胞定位。如果能夠確定目的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息和基因的編碼信息，接著用GFP、YFP的基因和目的蛋白質(zhì)的基因以融合蛋白質(zhì)方式導(dǎo)入質(zhì)粒載體，并且導(dǎo)入細胞，篩選陽性克隆，大規(guī)模培養(yǎng)陽性克隆，在細胞中以目的蛋白質(zhì)-GFP或YFP融合蛋白質(zhì)表達，最后后在外加光源激發(fā)的情況下，用熒光顯微鏡觀測以確定目的蛋白質(zhì)-GFP或YFP融合蛋白的具體的細胞定位位點。如果不能從現(xiàn)有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中知道的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息和基因的編碼信息，單憑自動測序儀測定的全新的目的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的信息，想獲得其全部基因的編碼也不是很容易，而且知道了想克隆出來也要費一些功夫。 �。�2）直接從細胞成分的分級分離確定目的蛋白質(zhì)的細胞定位。我們即使知道了目的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息和基因的編碼信息也沒有必要使用基因的編碼信息和GFP等，只要根據(jù)提取目的蛋白質(zhì)時的該種蛋白質(zhì)在細胞不同部位的豐度即可。目的蛋白質(zhì)與DNA片段相互作用并可能參與DNA的單鏈修復(fù)，那么當然在細胞核里應(yīng)該有，但是可能有細胞周期有關(guān)，所以可以在細胞周期的不同分布時期粉碎細胞，分級分離提純細胞核，而后粉碎細胞核后獲得確定目的蛋白質(zhì)，這樣也就證實了目的蛋白質(zhì)的細胞定位。 �。�3）顯微注射有熒光標記的抗體確定目的蛋白質(zhì)的細胞定位。不知道目的蛋白質(zhì)的基因也可以制備出目的蛋白質(zhì)的抗體，將分離提純出來的蛋白質(zhì)注射入家兔的體內(nèi)（可以加入免疫佐劑），數(shù)月后收獲抗體，分離純化抗體，不必是單克隆抗體，多克隆抗體即可。然后用熒光有機小分分子標記抗體（兩者共價連接），再用顯微注射法導(dǎo)入到含有目的蛋白質(zhì)的細胞，再用熒光顯微鏡觀測，也可以確定目的蛋白質(zhì)的細胞定位。 相比較而言，當然是直接從細胞成分的分級分離獲得目的蛋白質(zhì)的細胞定位最方便。 4.確定目的蛋白質(zhì)的進入細胞核的途徑，如果需要的話。 做這步實驗就需要確定目的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息和基因的編碼信息，如果能夠確定目的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息和基因的編碼信息，接著用GFP、YFP的基因和目的蛋白質(zhì)的基因以融合蛋白質(zhì)方式導(dǎo)入質(zhì)粒載體，并且導(dǎo)入細胞，篩選陽性克隆，大規(guī)模培養(yǎng)陽性克隆，在細胞中以目的蛋白質(zhì)-GFP或YFP融合蛋白質(zhì)表達，最后后在外加光源激發(fā)的情況下，用熒光顯微鏡觀測以確定目的蛋白質(zhì)-GFP或YFP融合蛋白的具體的進入細胞核的途徑，可以對于活細胞進行動態(tài)觀測。不過如此實驗實在是比較麻煩，如果不需要確定目的蛋白質(zhì)的進入細胞核的途徑，這一步就不要做了，即使要做，這一步與下面的實驗也沒有承接關(guān)系，可以平行進行。 直接用電子顯微鏡觀測效果不好，因為不好確定何時何種條件下，目的蛋白質(zhì)會恰好進入細胞核，即使觀察到蛋白質(zhì)會恰好進入細胞核，如何確定某個蛋白質(zhì)就是目的蛋白質(zhì)也不很容易。 確定目的蛋白質(zhì)與DNA片段能夠相互作用，并確定目的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合到DNA片段上的特異性序列。 DNA-Protein interaction的研究技術(shù)方法多了去了！電子顯微鏡直接觀測、NMR、DNA-Protein共結(jié)晶后X-ray diffraction、能量轉(zhuǎn)移、足跡法、干擾法、光活化的特異性位點的DNA-Protein交聯(lián)反應(yīng)、原子力顯微鏡液相直接觀測、全內(nèi)放射光學顯微鏡觀測等，你具體可以參考：·Tom Moss and Benoit Leblanc edit,DNA-Protein Interaction-----Principles and Protocols,Huamna Press,2009.下面僅舉三例以作說明。 （1）ChIP-chip。ChIP當然是很直接的試驗方法，你們實驗室也都做不了，那么就用足跡法吧。能夠使用ChIP芯片當然就更好了，不過估計絕大數(shù)實驗室目前沒有這個條件。足跡法實際上還是細胞外方法，雖然足跡法是細胞外方法，但是總可以確定該目的蛋白質(zhì)是與特定片段的DNA序列特異性結(jié)合的，并且找出具體結(jié)合的DNA片段。凝膠狀阻滯電泳也可以。 免疫沉淀（用類似免疫共沉淀的方法），但是不一定會成功。如果你能夠確定細胞大致在什么條件下會有目的蛋白質(zhì)結(jié)合于DNA片段上可能參與DNA修復(fù)，那么也可以用類似免疫共沉淀的方法獲得DNA-目的蛋白質(zhì)復(fù)合物，此時粉碎，在細胞提取液放入抗目蛋白質(zhì)的抗體（單抗或者多抗），攪拌均勻，然后加入共價連接有瓊脂糖磁珠的Protein A或Protein G，Protein A或Protein G會與抗目蛋白質(zhì)的抗體（單抗或者多抗）專一性結(jié)合，后者又會與目蛋白質(zhì)專一性結(jié)合，目的蛋白質(zhì)則會與DNA片段結(jié)合，這樣目的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物（同時連接著抗就被釣出來了，然后用離心方法很溶液獲得蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，但是這時目的蛋白質(zhì)-DNA-抗目的蛋白質(zhì)的抗體三元復(fù)合物很可能還非共價地連接著和共價連接有瓊脂糖磁珠的Protein A或Protein G，即次級鍵連接的四元復(fù)合物。如果能夠用一些分梯度的表面活性劑或者變性劑可能獲得蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物而把其他的成分分離下去，然后再用足跡法可以確定目的蛋白質(zhì)結(jié)合DNA的具體序列。但是這樣很難成功，這一實驗方案不一定能成功。那木應(yīng)該如何得到四元復(fù)合物中的目的蛋白質(zhì)則會與DNA片段結(jié)合的復(fù)合物，而去掉四元復(fù)合物中的其他的成分。最直接的辦法，模仿ChIP,只在在細胞外進行，離心分離到 目的蛋白質(zhì)-DNA-抗目的蛋白質(zhì)的抗體-共價連接有瓊脂糖磁珠的Protein A或Protein G，即次級鍵連接的四元復(fù)合物后，加入甲醛，形成DNA-目的蛋白質(zhì) cross linking complex，也就是把最為鄰近DNA的蛋白質(zhì)與DNA的非共價作用變?yōu)楣矁r鍵連接。當然，甲醛也有可能在抗目的蛋白質(zhì)的抗體-共價連接有瓊脂糖磁珠的Protein A或Protein G之間也可能構(gòu)成cross linking，甚至把目的蛋白質(zhì)-DNA-抗目的蛋白質(zhì)的抗體-共價連接有瓊脂糖磁珠的Protein A或Protein G四者通過DNA-Protein形成cross linking complex，如此也不難，只要走一下分子篩層析就行了，實在不知道分子篩層析哪個洗脫峰的歸屬，用質(zhì)譜測一下分子量。DNA的分子量不好確定，那么在用甲醛之前可以用限制性內(nèi)切酶充分切割DNA，讓留下的DNA片段盡量短些，再結(jié)合目的蛋白質(zhì)、抗體和瓊脂糖磁珠的Protein A或Protein G的紅外光譜特征與相對分子量，并不難確定分子篩層析各個洗脫峰的歸屬。當然如此操作還是不上算。所以接看下面的實驗方案。 （3）親和層析。更直接和更簡單的的實驗方法是將目的蛋白質(zhì)共價結(jié)合到葡聚糖層析柱的介質(zhì)上，然后用含有目的蛋白質(zhì)的細胞的總DNA過葡聚糖層析柱，再洗脫下來，即可得到與目的蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的DNA。 但是也有可能在不執(zhí)行DNA修復(fù)時，目的蛋白質(zhì)完全沒有專一性結(jié)合上DNA，這是就必須要人為制造出一些有缺陷的DNA片段，然后加入目的蛋白質(zhì)，用凝膠阻滯電泳加以比較，然后用足跡法確定具體結(jié)合位點。體外實驗時最好加入細胞核提取液，除去DNA。 確定目的蛋白質(zhì)與DNA片段能夠相互作用，并且參與了DNA單鏈的修復(fù)。可以用細胞外實驗，即用PCR引入突變或者PCR擴增DNA后使用產(chǎn)生修飾的化學試劑等方法產(chǎn)生有非正常的DNA雙鏈，而后加入目的蛋白質(zhì)和ATP、GTP，充分混合，并且加入目的蛋白質(zhì)所在的細胞核的提取液（除去DNA和組蛋白），然后過一段時間后提取非正常的DNA雙鏈加以測序,目的蛋白質(zhì)的確能夠起到修復(fù)作用的話，那么其可能與DNA修復(fù)有關(guān)。 使用RNAi,knock in,knock out等抑制或去除目的蛋白質(zhì)在細胞中的表達的方法也可以，但是首先需要了解如何檢測特定的DNA修復(fù)過程缺失所產(chǎn)生的表型變化，而且需要能夠游離培養(yǎng)含有目的蛋白質(zhì)的細胞。如果要對實驗動物做整體動物水平的檢測特定的DNA修復(fù)過程缺失所產(chǎn)生的表型變化，那要從胚胎干細胞做起，工作量太大了。 確定目的蛋白質(zhì)受到哪些細胞信號的調(diào)控，這包括確定細胞信號傳導(dǎo)途徑和目的蛋白質(zhì)受到的具體的基因表達調(diào)控或/和目的蛋白質(zhì)對于具體的基因表達調(diào)控的影響。這個題目就很大了，我不想敘述了。 如果要解析目的蛋白質(zhì)與DNA片段的相互作用的精細結(jié)構(gòu)，那么除了低溫冷凍電子顯微鏡、X-ray diffraction 解析目的蛋白質(zhì)與DNA片段的相互作用的單晶體精細結(jié)構(gòu)（如果能夠形成共結(jié)晶的單晶體的話）、NMR（需要在細胞生物合成目的蛋白質(zhì)之前加入自旋量子數(shù)不為零的元素標記物的氨基酸，并且使其摻入到目的蛋白質(zhì)，而且目的蛋白質(zhì)分子量小于40KD），毫無疑問，一般而言，第8步?jīng)]有必要在做了。 樓主給出的信息太少了，我只能說這些，而且說的內(nèi)容已經(jīng)太多了，有3500+字。 |
10樓2013-09-02 23:08:40
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵交流 2013-09-20 20:21:14
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我已經(jīng)想好了試驗方法，有很多種。我需要樓主先回答一些問題，以便對于試驗方法有所選擇。 1.該蛋白質(zhì)的識別DNA雙鏈是否有已知的DNA的二級結(jié)構(gòu)或者一級結(jié)構(gòu)信息，或者是否有同源蛋白的識別DNA雙鏈是否有已知的DNA的二級結(jié)構(gòu)或者一級結(jié)構(gòu)信息作為參考？ 2.目的蛋白質(zhì)的基因是否知道？或者是否有同源蛋白的基因已經(jīng)獲知？ 3.目的蛋白質(zhì)切割某一段DNA的雙鏈序列的一條鏈上切出一個缺口是僅切割不連接？還是既切又連？ 4.目的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是否已知？ 5.目的蛋白質(zhì)是否含有任何已知的輔基或者輔酶或者金屬離子？ 6.目的蛋白質(zhì)在不切割一段DNA的雙鏈序列的一條鏈時是否與DNA非共價結(jié)合？ 7.是否已知可能存在的目的蛋白質(zhì)的非共價結(jié)合的調(diào)控蛋白質(zhì)？ 8.目的蛋白質(zhì)的細胞定位是否已知？ 這些問題實際上都可能包含在我提供的protocols中，如果樓主希望我提供的protocols有具體的參考價值，請回答以上問題。對于以上問題沒有答案也是一種的有效的答案，對于選擇protocols仍然是有幫助的。 |
5樓2013-08-26 22:31:13
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3樓2013-08-24 11:13:54
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4樓2013-08-24 20:28:37
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6樓2013-08-26 23:05:28
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8樓2013-08-27 08:41:26
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