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[求助]
求助--肝微粒體孵育實驗
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各位蟲友，大家好，我最近在做肝微粒體孵育實驗 但是沒有反應(yīng)， 我的反應(yīng)體系是：肝微粒體 + 藥 + NADPH + Mgcl2 + 緩沖液 → 共1ml ， 先將 肝微粒體 + 藥 + Mgcl2 + 緩沖液37℃預(yù)孵育5min，NADPH 37℃預(yù)孵育5min 然后加到一塊，于5、10、20、30、60、90、120min取100ul加100ul冰冷的甲醇溶液并放入-20℃冰箱中終止反應(yīng)。 肝微粒體是直接買的，終濃度為1mg/ml。 NADPH四鈉鹽買的是羅氏的，用水配后分裝小瓶，-80度冷凍，隨用隨拿，反應(yīng)終濃度1mmol /L 。藥物先取了個中間值試試，是600 umol/L，還有一個終濃度5mmol/L的Mgcl2。肝微粒體和NADPH應(yīng)該都沒有什么問題啊 但是卻沒什么反應(yīng) 這是怎么回事呢 難道不該用NADPH或者是用水配不行？還是很說我的濃度有問題呢，我的緩沖液是ph7.4的磷酸鉀緩沖液， 望各位蟲友不吝賜教！金幣奉送！ [ Last edited by 1949stone on 2013-8-27 at 07:55 ] |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 |
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whyxmc: 回帖置頂 2013-08-28 07:10:12
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以下是我最終配置，希望您能看一下有哪里不對需要改正的，小妹初學，實屬菜鳥啊，忘提出寶貴意見： 1） 0.1mol/L 磷酸鉀緩沖溶液（PH 7.4） 配置：1mol/L的K2HPO4 取17.418 mg雙蒸水定容至100ml 取80.2ml 1mol/L的KH2PO4 取13.609 mg雙蒸水定容至100ml 取19.8ml 二者混合后用雙蒸水稀釋至1000ml，調(diào)ph至7.4。 即為0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液 2） 1mg/ml大鼠肝微粒體 原裝：10mg/ml 即1mg/100ul 收到分裝后立即將其放入到-80℃冰箱中，隨用隨拿，每次100ul 肝微粒體的復(fù)溶：放入4℃解凍，解凍后混合均勻即可，使用前保持低溫儲存。 3） 1mmol /L NADPH 原粉末25mg 分子量是833.4 用磷酸鉀緩沖液配 1mmol /L = 0.8334 mg/ ml，所以將0.8334ⅹ5=4.167mg加入1ml磷酸鉀緩沖液中，取200ul 即每200ul含0.8334mg，最后再使反應(yīng)體系體積為1ml，即是（終濃度為1mmol /L NADPH） 4） 5mmol/L Mgcl2 5mmol/L = 20.3mg定容至100ml ，即2.03mg定容至1ml 取100ul 5） 5umol/L – 500umol/L 底物 用PH 7.4磷酸鉀緩沖液配置 500 umol/L = 51.2 mg/L = 5.12mg/ml 即5.12mg定容1ml中取100ul 100 umol/L = 10.24 mg/L = 1.024mg/ml 取500 umol/L的底物100ul 稀釋到500ul 50 umol/L = 5.12mg/L 取500 umol/L的底物 10ul 稀釋到100ul 5 umol/L = 0.512 mg/L = 5.12mg/100ml 取50 umol/L的底物20ul 稀釋到200ul 孵育體系為1ml →加入100ul的肝微粒體（終濃度為1mg/ml） →加入200ul 5 umol/L p-II （終濃度為5 umol/L） 加入100ul 50 umol/L p-II （終濃度為50umol/L） 加入500ul 100 umol/L p-II （終濃度為100 umol/L） 加入100ul 500 umol/L p-II （終濃度為500 umol/L） →加入200ul的NADPH (終濃度為1mmol /L) →加入100ul的Mgcl2 (終濃度為5mmol/L) 依據(jù)底物濃度共分四組，最后每組都用磷酸鉀緩沖液補齊到1ml |
9樓2013-08-27 21:39:49
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+5, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-08-26 22:04:56
whyxmc: 金幣+200, ★★★很有幫助, 50 2013-08-27 06:51:02
1949stone: 樓上很滿意您的回答 收了人家200金 您可要幫忙幫到底啊 2013-08-27 07:54:52
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1949stone: 樓上很滿意您的回答 收了人家200金 您可要幫忙幫到底啊 2013-08-27 07:54:52
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要做肝微粒體實驗，首先需要搞清楚該藥物是經(jīng)由何種酶代謝的，是I相反應(yīng)的CYP酶或羧酸酯酶 ，還是說II相反應(yīng)的結(jié)合酶UGT酶，因為肝微粒體中主要是I相的CYP酶和羧酸酯酶和II相的UGT酶，像其他II相酶如GST等在肝微粒體中是沒有的。 確定了參與藥物代謝酶后才能考慮你要采用的酶源使用microsome，cytosol或是S9 藥物沒被代謝原因很多，你用的是底物消除還是代謝產(chǎn)物生成，產(chǎn)物生成的話是不是因為你所用的儀器靈敏度未達到所致，可以采用高靈敏度的檢測儀器，如LC-MS/MS等，底物消除的話會不會是因為底物消除的太少，此時可以適當提高酶濃度試一下。 還有你底物的終濃度是600μmol/L嗎？有可能是該底物濃度過高，將參與其代謝的酶的活性抑制掉了 NADPH一般是現(xiàn)配現(xiàn)用，每次稱粉末，一般是用你的緩沖鹽溶液溶解，不建議直接配好分裝，因為凍融對其活性也會有影響~ 綜上，還主要是從你的檢測靈敏度，藥物底物濃度，NADPH配制入手，逐個排除，希望你實驗早日有結(jié)果~ |
2樓2013-08-26 19:35:00
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以下是我最終配置，希望您能看一下有哪里不對需要改正的，小妹初學，實屬菜鳥啊，忘提出寶貴意見： 1） 0.1mol/L 磷酸鉀緩沖溶液（PH 7.4） 配置：1mol/L的K2HPO4 取17.418 mg雙蒸水定容至100ml 取80.2ml 1mol/L的KH2PO4 取13.609 mg雙蒸水定容至100ml 取19.8ml 二者混合后用雙蒸水稀釋至1000ml，調(diào)ph至7.4。 即為0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液 2） 1mg/ml大鼠肝微粒體 原裝：10mg/ml 即1mg/100ul 收到分裝后立即將其放入到-80℃冰箱中，隨用隨拿，每次100ul 肝微粒體的復(fù)溶：放入4℃解凍，解凍后混合均勻即可，使用前保持低溫儲存。 3） 1mmol /L NADPH 原粉末25mg 分子量是833.4 用磷酸鉀緩沖液配 1mmol /L = 0.8334 mg/ ml，所以將0.8334ⅹ5=4.167mg加入1ml磷酸鉀緩沖液中，取200ul 即每200ul含0.8334mg，最后再使反應(yīng)體系體積為1ml，即是（終濃度為1mmol /L NADPH） 4） 5mmol/L Mgcl2 5mmol/L = 20.3mg定容至100ml ，即2.03mg定容至1ml 取100ul 5） 5umol/L – 500umol/L 底物 用PH 7.4磷酸鉀緩沖液配置 500 umol/L = 51.2 mg/L = 5.12mg/ml 即5.12mg定容1ml中取100ul 100 umol/L = 10.24 mg/L = 1.024mg/ml 取500 umol/L的底物100ul 稀釋到500ul 50 umol/L = 5.12mg/L 取500 umol/L的底物 10ul 稀釋到100ul 5 umol/L = 0.512 mg/L = 5.12mg/100ml 取50 umol/L的底物20ul 稀釋到200ul 孵育體系為1ml →加入100ul的肝微粒體（終濃度為1mg/ml） →加入200ul 5 umol/L p-II （終濃度為5 umol/L） 加入100ul 50 umol/L p-II （終濃度為50umol/L） 加入500ul 100 umol/L p-II （終濃度為100 umol/L） 加入100ul 500 umol/L p-II （終濃度為500 umol/L） →加入200ul的NADPH (終濃度為1mmol /L) →加入100ul的Mgcl2 (終濃度為5mmol/L) 依據(jù)底物濃度共分四組，最后每組都用磷酸鉀緩沖液補齊到1ml |
10樓2013-08-29 15:24:40
3樓2013-08-27 06:57:35
★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金幣+5, 鼓勵回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
gyesang: 金幣+5, 鼓勵回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
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額，對的我覺得底物終濃度600μmol/L是有點太高了，因為有的藥物在濃度太高時同時也會是參與其反應(yīng)酶的抑制劑的，建議你降低濃度，一般在不好確定底物濃度時1μM不失為一個好的選擇。 還有一個關(guān)鍵的問題，你的底物是用什么溶劑配的，如果是有機溶劑的話，一定注意有機溶劑在你孵育體系中的總體積不超過孵育體積的1%，也就是說你1ml的孵育體系，底物頂多加到10μl NADPH一般終濃度1mM足夠了， 靈敏度的話如果在液相上可以看到，質(zhì)譜上應(yīng)該靈敏度是不存在問題的 ~你是沒有代謝產(chǎn)物標準品的嗎，那你要怎么確定代謝產(chǎn)物的MS條件呢，是直接找多余的離子碎片？ 希望問題解決了可以告訴我一聲~ |
4樓2013-08-27 10:03:35
5樓2013-08-27 14:38:48
6樓2013-08-27 16:18:07
7樓2013-08-27 18:22:02
8樓2013-08-27 20:59:59
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