 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 求助--肝微粒體孵育實驗
| 查看: 5569 | 回復: 20 | |||
[求助]
求助--肝微粒體孵育實驗
|
|||
|
各位蟲友，大家好，我最近在做肝微粒體孵育實驗 但是沒有反應， 我的反應體系是：肝微粒體 + 藥 + NADPH + Mgcl2 + 緩沖液 → 共1ml ， 先將 肝微粒體 + 藥 + Mgcl2 + 緩沖液37℃預孵育5min，NADPH 37℃預孵育5min 然后加到一塊，于5、10、20、30、60、90、120min取100ul加100ul冰冷的甲醇溶液并放入-20℃冰箱中終止反應。 肝微粒體是直接買的，終濃度為1mg/ml。 NADPH四鈉鹽買的是羅氏的，用水配后分裝小瓶，-80度冷凍，隨用隨拿，反應終濃度1mmol /L 。藥物先取了個中間值試試，是600 umol/L，還有一個終濃度5mmol/L的Mgcl2。肝微粒體和NADPH應該都沒有什么問題啊 但是卻沒什么反應 這是怎么回事呢 難道不該用NADPH或者是用水配不行？還是很說我的濃度有問題呢，我的緩沖液是ph7.4的磷酸鉀緩沖液， 望各位蟲友不吝賜教！金幣奉送！ [ Last edited by 1949stone on 2013-8-27 at 07:55 ] |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 分子生化實驗經(jīng)驗積累 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有90人回復
-
蛋白質(zhì)檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 求助 NADPH再生系統(tǒng)
已經(jīng)有2人回復
- 求助肝微粒體外實驗方法
已經(jīng)有2人回復
- 【求助】大鼠肝微粒體孵育系統(tǒng)的緊急問題��！
已經(jīng)有2人回復
- 【求助】肝微粒體不代謝--急死人啦
已經(jīng)有12人回復
- 【求助】求教肝微粒體體外代謝實驗問題
已經(jīng)有20人回復
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感謝參與，應助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+5, 鼓勵回帖應助！ 2013-08-26 22:04:56
whyxmc: 金幣+200, ★★★很有幫助, 50 2013-08-27 06:51:02
1949stone: 樓上很滿意您的回答 收了人家200金 您可要幫忙幫到底啊 2013-08-27 07:54:52
感謝參與，應助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+5, 鼓勵回帖應助！ 2013-08-26 22:04:56
whyxmc: 金幣+200, ★★★很有幫助, 50 2013-08-27 06:51:02
1949stone: 樓上很滿意您的回答 收了人家200金 您可要幫忙幫到底啊 2013-08-27 07:54:52
|
要做肝微粒體實驗，首先需要搞清楚該藥物是經(jīng)由何種酶代謝的，是I相反應的CYP酶或羧酸酯酶 ，還是說II相反應的結合酶UGT酶，因為肝微粒體中主要是I相的CYP酶和羧酸酯酶和II相的UGT酶，像其他II相酶如GST等在肝微粒體中是沒有的。 確定了參與藥物代謝酶后才能考慮你要采用的酶源使用microsome，cytosol或是S9 藥物沒被代謝原因很多，你用的是底物消除還是代謝產(chǎn)物生成，產(chǎn)物生成的話是不是因為你所用的儀器靈敏度未達到所致，可以采用高靈敏度的檢測儀器，如LC-MS/MS等，底物消除的話會不會是因為底物消除的太少，此時可以適當提高酶濃度試一下。 還有你底物的終濃度是600μmol/L嗎？有可能是該底物濃度過高，將參與其代謝的酶的活性抑制掉了 NADPH一般是現(xiàn)配現(xiàn)用，每次稱粉末，一般是用你的緩沖鹽溶液溶解，不建議直接配好分裝，因為凍融對其活性也會有影響~ 綜上，還主要是從你的檢測靈敏度，藥物底物濃度，NADPH配制入手，逐個排除，希望你實驗早日有結果~ |
2樓2013-08-26 19:35:00
whyxmc: 回帖置頂 2013-08-28 07:10:12
|
以下是我最終配置，希望您能看一下有哪里不對需要改正的，小妹初學，實屬菜鳥啊，忘提出寶貴意見： 1） 0.1mol/L 磷酸鉀緩沖溶液（PH 7.4） 配置：1mol/L的K2HPO4 取17.418 mg雙蒸水定容至100ml 取80.2ml 1mol/L的KH2PO4 取13.609 mg雙蒸水定容至100ml 取19.8ml 二者混合后用雙蒸水稀釋至1000ml，調(diào)ph至7.4。 即為0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液 2） 1mg/ml大鼠肝微粒體 原裝：10mg/ml 即1mg/100ul 收到分裝后立即將其放入到-80℃冰箱中，隨用隨拿，每次100ul 肝微粒體的復溶：放入4℃解凍，解凍后混合均勻即可，使用前保持低溫儲存。 3） 1mmol /L NADPH 原粉末25mg 分子量是833.4 用磷酸鉀緩沖液配 1mmol /L = 0.8334 mg/ ml，所以將0.8334ⅹ5=4.167mg加入1ml磷酸鉀緩沖液中，取200ul 即每200ul含0.8334mg，最后再使反應體系體積為1ml，即是（終濃度為1mmol /L NADPH） 4） 5mmol/L Mgcl2 5mmol/L = 20.3mg定容至100ml ，即2.03mg定容至1ml 取100ul 5） 5umol/L – 500umol/L 底物 用PH 7.4磷酸鉀緩沖液配置 500 umol/L = 51.2 mg/L = 5.12mg/ml 即5.12mg定容1ml中取100ul 100 umol/L = 10.24 mg/L = 1.024mg/ml 取500 umol/L的底物100ul 稀釋到500ul 50 umol/L = 5.12mg/L 取500 umol/L的底物 10ul 稀釋到100ul 5 umol/L = 0.512 mg/L = 5.12mg/100ml 取50 umol/L的底物20ul 稀釋到200ul 孵育體系為1ml →加入100ul的肝微粒體（終濃度為1mg/ml） →加入200ul 5 umol/L p-II （終濃度為5 umol/L） 加入100ul 50 umol/L p-II （終濃度為50umol/L） 加入500ul 100 umol/L p-II （終濃度為100 umol/L） 加入100ul 500 umol/L p-II （終濃度為500 umol/L） →加入200ul的NADPH (終濃度為1mmol /L) →加入100ul的Mgcl2 (終濃度為5mmol/L) 依據(jù)底物濃度共分四組，最后每組都用磷酸鉀緩沖液補齊到1ml |
9樓2013-08-27 21:39:49
|
以下是我最終配置，希望您能看一下有哪里不對需要改正的，小妹初學，實屬菜鳥啊，忘提出寶貴意見： 1） 0.1mol/L 磷酸鉀緩沖溶液（PH 7.4） 配置：1mol/L的K2HPO4 取17.418 mg雙蒸水定容至100ml 取80.2ml 1mol/L的KH2PO4 取13.609 mg雙蒸水定容至100ml 取19.8ml 二者混合后用雙蒸水稀釋至1000ml，調(diào)ph至7.4。 即為0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液 2） 1mg/ml大鼠肝微粒體 原裝：10mg/ml 即1mg/100ul 收到分裝后立即將其放入到-80℃冰箱中，隨用隨拿，每次100ul 肝微粒體的復溶：放入4℃解凍，解凍后混合均勻即可，使用前保持低溫儲存。 3） 1mmol /L NADPH 原粉末25mg 分子量是833.4 用磷酸鉀緩沖液配 1mmol /L = 0.8334 mg/ ml，所以將0.8334ⅹ5=4.167mg加入1ml磷酸鉀緩沖液中，取200ul 即每200ul含0.8334mg，最后再使反應體系體積為1ml，即是（終濃度為1mmol /L NADPH） 4） 5mmol/L Mgcl2 5mmol/L = 20.3mg定容至100ml ，即2.03mg定容至1ml 取100ul 5） 5umol/L – 500umol/L 底物 用PH 7.4磷酸鉀緩沖液配置 500 umol/L = 51.2 mg/L = 5.12mg/ml 即5.12mg定容1ml中取100ul 100 umol/L = 10.24 mg/L = 1.024mg/ml 取500 umol/L的底物100ul 稀釋到500ul 50 umol/L = 5.12mg/L 取500 umol/L的底物 10ul 稀釋到100ul 5 umol/L = 0.512 mg/L = 5.12mg/100ml 取50 umol/L的底物20ul 稀釋到200ul 孵育體系為1ml →加入100ul的肝微粒體（終濃度為1mg/ml） →加入200ul 5 umol/L p-II （終濃度為5 umol/L） 加入100ul 50 umol/L p-II （終濃度為50umol/L） 加入500ul 100 umol/L p-II （終濃度為100 umol/L） 加入100ul 500 umol/L p-II （終濃度為500 umol/L） →加入200ul的NADPH (終濃度為1mmol /L) →加入100ul的Mgcl2 (終濃度為5mmol/L) 依據(jù)底物濃度共分四組，最后每組都用磷酸鉀緩沖液補齊到1ml |
10樓2013-08-29 15:24:40
3樓2013-08-27 06:57:35
★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金幣+5, 鼓勵回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
gyesang: 金幣+5, 鼓勵回帖交流！ 2013-08-27 17:15:11
|
額，對的我覺得底物終濃度600μmol/L是有點太高了，因為有的藥物在濃度太高時同時也會是參與其反應酶的抑制劑的，建議你降低濃度，一般在不好確定底物濃度時1μM不失為一個好的選擇。 還有一個關鍵的問題，你的底物是用什么溶劑配的，如果是有機溶劑的話，一定注意有機溶劑在你孵育體系中的總體積不超過孵育體積的1%，也就是說你1ml的孵育體系，底物頂多加到10μl NADPH一般終濃度1mM足夠了， 靈敏度的話如果在液相上可以看到，質(zhì)譜上應該靈敏度是不存在問題的 ~你是沒有代謝產(chǎn)物標準品的嗎，那你要怎么確定代謝產(chǎn)物的MS條件呢，是直接找多余的離子碎片？ 希望問題解決了可以告訴我一聲~ |
4樓2013-08-27 10:03:35
5樓2013-08-27 14:38:48
6樓2013-08-27 16:18:07
7樓2013-08-27 18:22:02
8樓2013-08-27 20:59:59
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 whyxmc 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +9 | 小熊joy 2026-03-14 | 9/450 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +3 | 簡單點0 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +3 | 睿08 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
[考研] 材料，紡織，生物（0856、0710），化學招生啦 +3 | Eember. 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +4 | knight344 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 326求調(diào)劑 +5 | 上岸的小葡 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 312求調(diào)劑 +4 | 陌宸希 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 267一志愿南京工業(yè)大學0817化工求調(diào)劑 +6 | SUICHILD 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 文思客 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703 物理化學調(diào)劑 +3 | 我可以上岸的對?/a> 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070305求調(diào)劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[基金申請]
有必要更換申報口嗎
 20+3
|
fannyamoy 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學一志愿211 總分320求調(diào)劑 +5 | 瑪卡巴卡啊哈 2026-03-11 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 工科材料085601 279求調(diào)劑 +8 | 困于星晨 2026-03-12 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +3 | 小匕仔汁 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +3 | S.H1 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿山大07化學 332分 四六級已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！ +3 | 不想理你 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0817化學工程與技術考研312分調(diào)劑 +3 | T123 tt 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +3 | ADT 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 2026年博士申請 +3 | QwQwQW10 2026-03-11 | 3/150 |
|