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whyxmc新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助--肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)
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各位蟲友，大家好，我最近在做肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn) 但是沒有反應(yīng)， 我的反應(yīng)體系是：肝微粒體 + 藥 + NADPH + Mgcl2 + 緩沖液 → 共1ml ， 先將 肝微粒體 + 藥 + Mgcl2 + 緩沖液37℃預(yù)孵育5min，NADPH 37℃預(yù)孵育5min 然后加到一塊，于5、10、20、30、60、90、120min取100ul加100ul冰冷的甲醇溶液并放入-20℃冰箱中終止反應(yīng)。 肝微粒體是直接買的，終濃度為1mg/ml。 NADPH四鈉鹽買的是羅氏的，用水配后分裝小瓶，-80度冷凍，隨用隨拿，反應(yīng)終濃度1mmol /L 。藥物先取了個中間值試試，是600 umol/L，還有一個終濃度5mmol/L的Mgcl2。肝微粒體和NADPH應(yīng)該都沒有什么問題啊 但是卻沒什么反應(yīng) 這是怎么回事呢 難道不該用NADPH或者是用水配不行？還是很說我的濃度有問題呢，我的緩沖液是ph7.4的磷酸鉀緩沖液， 望各位蟲友不吝賜教！金幣奉送！ [ Last edited by 1949stone on 2013-8-27 at 07:55 ] |
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whyxmc
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3樓2013-08-27 06:57:35
yhang
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【答案】應(yīng)助回帖
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1949stone: 樓上很滿意您的回答 收了人家200金 您可要幫忙幫到底啊 2013-08-27 07:54:52
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1949stone: 樓上很滿意您的回答 收了人家200金 您可要幫忙幫到底啊 2013-08-27 07:54:52
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要做肝微粒體實(shí)驗(yàn)，首先需要搞清楚該藥物是經(jīng)由何種酶代謝的，是I相反應(yīng)的CYP酶或羧酸酯酶 ，還是說II相反應(yīng)的結(jié)合酶UGT酶，因?yàn)楦挝⒘ｓw中主要是I相的CYP酶和羧酸酯酶和II相的UGT酶，像其他II相酶如GST等在肝微粒體中是沒有的。 確定了參與藥物代謝酶后才能考慮你要采用的酶源使用microsome，cytosol或是S9 藥物沒被代謝原因很多，你用的是底物消除還是代謝產(chǎn)物生成，產(chǎn)物生成的話是不是因?yàn)槟闼玫膬x器靈敏度未達(dá)到所致，可以采用高靈敏度的檢測儀器，如LC-MS/MS等，底物消除的話會不會是因?yàn)榈孜锵奶�，此時可以適當(dāng)提高酶濃度試一下。 還有你底物的終濃度是600μmol/L嗎？有可能是該底物濃度過高，將參與其代謝的酶的活性抑制掉了 NADPH一般是現(xiàn)配現(xiàn)用，每次稱粉末，一般是用你的緩沖鹽溶液溶解，不建議直接配好分裝，因?yàn)閮鋈趯ζ浠钚砸矔杏绊憕 綜上，還主要是從你的檢測靈敏度，藥物底物濃度，NADPH配制入手，逐個排除，希望你實(shí)驗(yàn)早日有結(jié)果~ |
2樓2013-08-26 19:35:00
yhang
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額，對的我覺得底物終濃度600μmol/L是有點(diǎn)太高了，因?yàn)橛械乃幬镌跐舛忍邥r同時也會是參與其反應(yīng)酶的抑制劑的，建議你降低濃度，一般在不好確定底物濃度時1μM不失為一個好的選擇。 還有一個關(guān)鍵的問題，你的底物是用什么溶劑配的，如果是有機(jī)溶劑的話，一定注意有機(jī)溶劑在你孵育體系中的總體積不超過孵育體積的1%，也就是說你1ml的孵育體系，底物頂多加到10μl NADPH一般終濃度1mM足夠了， 靈敏度的話如果在液相上可以看到，質(zhì)譜上應(yīng)該靈敏度是不存在問題的 ~你是沒有代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的嗎，那你要怎么確定代謝產(chǎn)物的MS條件呢，是直接找多余的離子碎片？ 希望問題解決了可以告訴我一聲~ |
4樓2013-08-27 10:03:35
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5樓2013-08-27 14:38:48
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