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qsx04152006木蟲 (知名作家)
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[求助]
SOE-PCR
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本人準(zhǔn)備將兩端基因連接在一起，一段長(zhǎng)1620bp，，另一端長(zhǎng)106bp，不知道用SOE-PCR能否將他們連接在一起。 1、107bp做pcr容易擴(kuò)嗎，產(chǎn)生引物二聚體的話怎么回收？ 2、我的引物設(shè)計(jì)是否合適？重疊部分為20bp 基因1的序列：ATGGGGACAGTTAATAAACCTGTG.......CACTTCTACGATATGCCGCA 上游引物A：ATGGGGACAGTTAATAAACCTGTG（24bp） 下游引物B: GAATAAATTGACAATATTTG+TGCGGCATATCGTAGAAGTG 基因2的序列,106+TAA：CAAATATTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGCTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAA+TAA（共109bp） 上游引物C：CACTTCTACGATATGCCGCA（20bp，基因1的3”端20bp序列）+ CAAATATTGTCAATTTATTC（基因2的5“端20bp） 下游引物D：TTATTCTGCATTGTAACGACCCATTG（26bp），其中用引物A和B擴(kuò)增基因1，用引物C和D擴(kuò)增基因2，然后用各自的PCR產(chǎn)物做模板，不加引物空延伸7個(gè)循環(huán)，再用引物A和D為引物，以上步空延伸的產(chǎn)物做模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣是否可行？請(qǐng)大家指點(diǎn)，謝謝！ |
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qsx04152006
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2樓2013-09-04 11:13:28
chjinzhi
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3樓2013-09-04 17:27:12
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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qsx04152006: 金幣+5, ★有幫助, 能介紹一下touchdown-pcr嗎？ 2013-09-05 11:48:02
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1。107bp的片段還是容易擴(kuò)增的。不是有膠回收嘛，怕啥引物二聚體呀！條帶大小又不一樣，實(shí)在不行，你提高瓊脂糖濃度唄，那樣分離更徹底一些。 2具體的還要看你用的酶，引物的退火溫度等，設(shè)計(jì)程序還要注意延伸的時(shí)間。如果嘗試了很多還是不行就利用touchdown-PCR試試吧。 |
4樓2013-09-04 17:34:41
qsx04152006
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