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yinjuanchen鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)溶劑比例
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Q1：如題，用質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)，ESI源，在保證蛋白質(zhì)不變性的前提下，有經(jīng)驗(yàn)的前輩推薦下溶劑甲醇和水的比例。（我用1:1的比例，發(fā)生的嚴(yán)重的變性，只用水作溶劑，由于儀器本身的限制，電離電壓最大為5500V，不能電離） Q2:通過質(zhì)譜圖的電荷分布，為何可以知道溶液中蛋白質(zhì)存在幾種構(gòu)象？（構(gòu)象不同，所帶電荷不同，但怎么區(qū)分不同的構(gòu)象，譜圖有什么特征？） 謝謝！ [ 來自小組 Ocean家族 ] |
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yinjuanchen: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝！ 2013-09-26 08:08:40
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蛋白不變性指的是intact protein 的表征嗎？一般0.1%的酸就變性了吧。 如果只是想知道分子量，那么將樣品變性，除鹽，在良溶劑中(水，ACN, MeOH) 加0.1%的酸所使用的樣品量并不比直接帶buffer檢測所用量多。 如果要在buffer中，保持蛋白不變性的化，要求質(zhì)譜能夠檢測到蛋白的話，一般來說蛋白的濃度要和buffer的濃度相當(dāng)（即蛋白的濃度不小于buffer濃度的十倍). 同時(shí)使用buffer的濃度最大不超過10mM，優(yōu)先使用可以氣化的buffer （比如NH4HCO3, NH4Ac). 再其次的buffer是tris buffer。 如果蛋白溶在鈉鹽，鉀鹽之類的buffer中，可以通過透析交換buffer. 表面活性劑對蛋白的檢測干擾也非常大。如果buffer中含有表面活性劑，要通過超濾膜(比如分子量截留1000， 3000，5000，10，000)等等，除掉不相干的小分子。 搜a(bǔ)ldrich, millipore蛋白純化產(chǎn)品，可以看到一系列的蛋白質(zhì)除鹽，緩沖液交換，樣品濃縮，超濾膜等等相關(guān)的產(chǎn)品。 實(shí)在不行，可以將樣品送到蛋白質(zhì)組學(xué)分析檢測中心，附帶蛋白純化要求。 |
6樓2013-09-25 10:44:27
lzjessie_wlf
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【答案】應(yīng)助回帖
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yinjuanchen: 金幣+1, ★有幫助, 謝謝！ 2013-09-26 08:08:58
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Q2 簡單來說，蛋白的構(gòu)象越團(tuán)簇，或者說縮成一團(tuán)，那么它暴露在外面的可被質(zhì)子化的個(gè)數(shù) 或者說戴電荷的個(gè)數(shù)會越少。 越緊縮的構(gòu)象，所帶電荷越少，那么蛋白在m/z較大區(qū)域的分布信號就會越強(qiáng)。 質(zhì)譜圖上，蛋白相關(guān)的多電荷峰會往m/z大的區(qū)域偏移。 加強(qiáng)酸denature后，m/z信號往小的區(qū)域偏移。 同一溶液中，蛋白同時(shí)存在幾種構(gòu)象，并且具體如何區(qū)分這幾種構(gòu)象，我就不太清楚了。 |
7樓2013-09-25 11:03:53
yinjuanchen
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9樓2013-09-26 08:20:09
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