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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 怎么測膜蛋白
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怎么測膜蛋白
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| 想測腫瘤細胞膜蛋白的表達，但細胞內(nèi)也有該蛋白，用哪些方法可以檢測？ |
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 細胞生物學實驗經(jīng)驗 |
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凌波麗
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【答案】應助回帖
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首先把細胞膜分離出來，接著在分離膜蛋白就行了。 很多公司有膜蛋白提取試劑盒，用有機溶劑抽提的，不用超速離心，普通的離心機就可以。具體實驗方案，可以參考有關細胞生物學實驗手冊，或者試劑盒說明書。下面以大鼠肝臟中細胞膜的分離舉例說明操作步驟。 舉例： 大鼠肝臟中細胞膜的分離 一、.試劑：勻漿介質(zhì)：25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L氯化鎂溶液、10mmol/L Tris-HCl,pH=7.4 高密度蔗糖溶液：2.0mol/L蔗糖溶液、1mmol/L氯化鎂溶液、10mmol/L Tris-HCl,pH=7.4 向以上兩種溶液中加入蛋白酶抑制劑。 二、實驗動物：成年雄性大鼠一只 三、器材：低溫冷凍離心機、勻漿器、血液尼龍過濾網(wǎng)（孔徑750um)、注射器（帶金屬套管針）、超速離心機。 四、操作步驟： 以下所有實驗操作在4度環(huán)境下進行。 1.提取麻醉后剛剛處死的大鼠肝臟并稱重，然后在冰上燒杯中用剪刀完全剁碎。事先對大鼠麻醉，并對其門靜脈灌注20mL勻漿介質(zhì)。 2.用剁碎物在勻漿介質(zhì)中混勻（大約4mL/g肝臟）。 3.用勻漿器對于剁碎物進行勻漿。 5.用血液尼龍過濾網(wǎng)去除未被粉碎的細胞和結(jié)締組織，并用玻璃棒攪拌以利于過濾。 6.用濃度為5mL/g的勻漿介質(zhì)來稀釋濾液，分裝于兩個50mL的離心管中，在280g下離心10分鐘。 7.用濃度為粉碎細胞后分離離心細胞成分，勻漿，即可分離出細胞膜。 8.用注射器和金屬套管針吸取上清液。 9.在280g下離心獲得的上清液在1500g下離心10分鐘；緩慢倒掉上清液。 10.再使用勻漿器對1500g下離心10分鐘得到的沉淀物放入25mL的勻漿介質(zhì)中重懸，與2倍前面液體的體積的高密度蔗糖溶液混勻。 11.用Beckman（或者其他品牌）的離心機在113000g離心1小時，如果樣品體積不夠離心管的裝液標準，則用勻漿介質(zhì)加以補充。 12.用注射器和金屬套管針吸取在界面上呈帶狀分布的細胞膜片段。 13.用勻漿介質(zhì)將12得到的混懸液適當稀釋后（離心管的裝液標準），在離心機上用3000g離心10分鐘以收集細胞膜。 |
8樓2013-09-06 23:23:43
凌波麗
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2樓2013-09-06 12:15:57
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【答案】應助回帖
| “想測腫瘤細胞膜蛋白的表達，但細胞內(nèi)也有該蛋白，用哪些方法可以檢測”，表達量？表達位點？與時間的表達關系？蛋白質(zhì)在生物膜上的裝配？蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和折疊狀態(tài)？蛋白質(zhì)的折疊路徑？蛋白質(zhì)的基因表達調(diào)控因子？蛋白質(zhì)的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡？蛋白質(zhì)的功能實現(xiàn)的相互作用網(wǎng)絡？可以檢測的東西多了去了。請你說明白你要檢測什么？希望用什么實驗技術檢測？不然我給你寫出幾千字，你一句話：我不檢測這些！我們實驗室沒有這樣的技術設備！我不是白寫了嗎？ |
3樓2013-09-06 12:21:53
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5樓2013-09-06 12:26:08
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