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高手請進(jìn)--金黃色葡萄球菌的electroporation問題
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各位蟲友們， 目前這個問題已經(jīng)困惑我了將近半年的時間，真心的懇請蟲友們幫幫我。 為了做一個臨床株的mutant strain， 我需要將一個重組的plasmid通過electroporation導(dǎo)入到這個金黃色葡萄球菌中。已經(jīng)幾乎確定過了所有步驟沒有弄錯--先酶切質(zhì)粒和target DNA--進(jìn)行l(wèi)igation之后--tansformation到E.coli(DH5a)--electroporation到RN4220--細(xì)菌正常長出--再提質(zhì)粒--electroporation到這個臨床株的competent cells-------------什么也沒長出來（大概做了幾十次，從檢查competent cells到重組plasmid測序及PCR確認(rèn)等等）�。�！ 真心著急，pasmid進(jìn)不去，就做不了mutant strain，實驗就不能繼續(xù)往下進(jìn)行。希望蟲友們能給出一些指點(diǎn)，建議，和一些相關(guān)資料能供我學(xué)習(xí)。在此，先謝過了��！   |
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2樓2013-09-10 16:44:25
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3樓2013-09-10 16:46:07
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yangtingli
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【答案】應(yīng)助回帖
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myprayer: 金幣+5, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待更詳細(xì)的解答 2013-10-10 09:57:53
yuliansheng: 金幣+5, ★有幫助, 我知道你說的這些方法，我也是先電轉(zhuǎn)質(zhì)粒到RN4220，然后再提質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)到我所研究的臨床aureus株。試了好多好多次，包括電轉(zhuǎn)條件，加入質(zhì)粒的量等等，都沒能成功導(dǎo)入質(zhì)粒。你說的那篇文章我也讀過，也試過里面所說的方法，也沒能成功。（你所說的那篇文章是Transforming the Untransformable: Application of Direct Transformation To Manipulate Genetically Staphylococcus aureusand Staphylococcus epidermidis） 不過還是很感謝你。還有其他的方法或關(guān)于這方便的信息嗎？ 2013-10-28 19:33:49
myprayer: 金幣+5, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待更詳細(xì)的解答 2013-10-10 09:57:53
yuliansheng: 金幣+5, ★有幫助, 我知道你說的這些方法，我也是先電轉(zhuǎn)質(zhì)粒到RN4220，然后再提質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)到我所研究的臨床aureus株。試了好多好多次，包括電轉(zhuǎn)條件，加入質(zhì)粒的量等等，都沒能成功導(dǎo)入質(zhì)粒。你說的那篇文章我也讀過，也試過里面所說的方法，也沒能成功。（你所說的那篇文章是Transforming the Untransformable: Application of Direct Transformation To Manipulate Genetically Staphylococcus aureusand Staphylococcus epidermidis） 不過還是很感謝你。還有其他的方法或關(guān)于這方便的信息嗎？ 2013-10-28 19:33:49
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你直接用質(zhì)粒 電轉(zhuǎn) RN4220 時，可以加大質(zhì)粒用量，可以加到5ug，提高電轉(zhuǎn)效率。 另外，也不可以試試不借助RN4220，我不知道，你最終要把質(zhì)粒放在哪個菌株。 在你做轉(zhuǎn)化時，轉(zhuǎn)入了DH5a, 這一步，可以用 E.coli DC10B，這是個為轉(zhuǎn)化S.aureus設(shè)計的菌株，E.coli DH10B的突變體。 我是直接轉(zhuǎn)進(jìn) DC10B, 然后提取質(zhì)粒 鑒定， 電轉(zhuǎn) S.aureus Newman，中間不經(jīng)過RN4220，還挺容易的。 你可以找下 E.coli DC10B的文獻(xiàn) |
6樓2013-10-10 06:09:18
tanxiaojuan
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10樓2015-12-18 11:09:26
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