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hqc87鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
如何確定一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的特定DNA序列
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| 最近用酵母單雜篩出一個(gè)能結(jié)合于我的基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子（該轉(zhuǎn)錄因子已知信息很少），并用Gap repair 驗(yàn)證該轉(zhuǎn)錄因子確實(shí)能結(jié)合于我的啟動(dòng)子上，我用于做酵母單雜的啟動(dòng)子長(zhǎng)度是749bp，我的問(wèn)題是如何找出這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在這749bp的哪幾個(gè)特定堿基上？我也搜索了DNA footprinting 方法，感覺(jué)都是在驗(yàn)證蛋白于DNA的結(jié)合與否，如何測(cè)定結(jié)合部位的序列并沒(méi)有太詳細(xì)的參考資料。求做過(guò)此方面的同學(xué)、老師獻(xiàn)謀獻(xiàn)計(jì)，給出整體方案后，最好也提供詳細(xì)的步驟，謝謝。 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-09-20 00:17:18
hqc87: 金幣+5, 謝謝回復(fù) 2013-09-20 05:43:05
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http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6271476&authorid=1766465 請(qǐng)參考該貼的回答的第十樓，我寫的回帖內(nèi)容。愿意討論我們繼續(xù)討論。 |
2樓2013-09-19 20:26:05
hqc87
鐵蟲 (小有名氣)
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看了您的回帖，感覺(jué)你確實(shí)熟悉很多技術(shù)，我很多都沒(méi)有聽(tīng)說(shuō)過(guò)，而且實(shí)驗(yàn)室條件也不允許。目前我的情況是轉(zhuǎn)錄因子是從商業(yè)轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)里篩出的，序列知道，但是BLAST后并沒(méi)有太多信息都是uncharacterized protein，所以其功能未知，通過(guò)單雜確定其能結(jié)合到我的啟動(dòng)子上但是啟動(dòng)子太長(zhǎng)，如何找到其結(jié)合的某幾個(gè)特定堿基，貌似可以用DNA footprinting。我的問(wèn)題是1.DNA 足跡法一般用較短的DNA序列，首先我的啟動(dòng)子750bp是不是需要用限制酶切成幾個(gè)小片段再分別做？2.DNAase I處理跑膠后，和蛋白結(jié)合的DNA不被切割在膠上顯示出空白區(qū)，僅看到有空白區(qū)不夠啊，只能證明確實(shí)跟這個(gè)蛋白結(jié)合了，但是結(jié)合的特定部位的序列如何得知？ |
3樓2013-09-20 05:41:53
凌波麗
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4樓2013-09-20 11:34:22
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-09-20 20:00:36
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hqc87: 金幣+10, 謝謝回復(fù) 2013-09-21 05:22:22
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用 Chromatin Immunoprecipitation Assays能夠直接 確定DNA與Protein相互作用的直接的結(jié)合的DNA片段。請(qǐng)見(jiàn)： Trygve O. Tollefsbol edits,Epigenetics Protocols(MMB-287)，Huamana Press,2004 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6383180 也就是ChIP。 |
5樓2013-09-20 11:54:22
hqc87
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CHIP確實(shí)能檢測(cè)特定蛋白結(jié)合的DNA序列，但是由于條件限制（制備抗體、沉降的DNA片段大量測(cè)序等）且目前還不知道該蛋白的功能性，所以估計(jì)老板不會(huì)同意，而我的情況是已經(jīng)知道該蛋白結(jié)合到我的特定啟動(dòng)子上了，也就是有了這么一個(gè)750bp的范圍了，感覺(jué)做CHIP也有點(diǎn)太多了，因?yàn)镃HIP可以檢測(cè)整個(gè)基因組。所以還是考慮做下DNA footprinting吧，雖然比較麻煩要用到放射而且還要跑我不太清楚的測(cè)序膠，但是只能這樣了，如果您有好的DNA 足跡法詳細(xì)protocol（要從蛋白原核表達(dá)到足跡后對(duì)足跡片段測(cè)序的完整步驟的，最關(guān)鍵的是對(duì)足跡片段測(cè)序這一步驟），麻煩推薦一下，謝謝熱心回復(fù)。 |
6樓2013-09-21 05:21:54
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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足跡法保護(hù)的DNA片段測(cè)序就用以化學(xué)法或者sanger法為基礎(chǔ)的自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序，遇到有修飾堿基則位點(diǎn)在機(jī)器上讀不出來(lái)，但是其他位點(diǎn)能讀出。面對(duì)這樣的情況，用限制性內(nèi)切酶，從離未知位點(diǎn)的最靠近的已知序列的用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)處切開，然后把帶有遇到有修飾堿基則位點(diǎn)在機(jī)器上讀不出來(lái)的DNA片段用質(zhì)譜鑒定即可。 帶有遇到有修飾堿基則位點(diǎn)在機(jī)器上讀不出來(lái)的DNA片段用質(zhì)譜鑒定實(shí)際上就是把dsDNA fragments變?yōu)閟sDNA fragments，然后通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定出修飾堿基的特異性斷裂的分子量，從相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到有關(guān)堿基的分子量確定該堿基的類型，這部分有質(zhì)譜儀自身的軟件和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)完成。 |
7樓2013-09-21 10:14:55
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