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求分枝桿菌基因組的提取方法
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wwdxx2004: 金幣+1, ★有幫助, 謝謝！ 2013-10-04 11:06:16
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-10-04 11:07:27
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1.滅活的斜面加入2mlTE，取1ml，12 000rpm，5min，棄上清。 2.沉淀物加入565μl的TE緩沖液，吸管反復(fù)吹打使之重懸，置于-70℃冰箱中放置過(guò)夜。加入5μl蛋白酶K、30μl 10%SDS，混勻，于65℃溫育>1h。 3.加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），混勻，12000rpm，5min，將上清液轉(zhuǎn)入一只新管中。 4.加入0.6體積冰異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，-20℃靜置20min，12000rpm，5min，棄上清。1ml的70%冰乙醇洗滌。 5.12000rpm，5min，棄上清，室溫干燥，重溶于40μl的TE緩沖液。 這個(gè)是結(jié)核分枝桿菌的。 |
2樓2013-10-04 10:44:08
3樓2013-10-04 11:07:23
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wwdxx2004: 金幣+1, ★有幫助 2013-10-08 14:31:24
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可以用磁珠法試試，我也沒(méi)做過(guò)。應(yīng)該可以。 菌落PCR是直接把菌通過(guò)槍頭或其他物品轉(zhuǎn)移到PCR體系中，在94℃變性時(shí)，細(xì)菌一般會(huì)被煮裂解，基因組和質(zhì)粒直接被釋放出來(lái)作為模板； 普通PCR用的DNA模板是經(jīng)提純后的DNA，例如質(zhì)粒，cDNA、genome等； 由于蛋白和其它雜質(zhì)干擾的存在，菌落PCR效果一般比普通PCR效果差。 |
4樓2013-10-05 12:56:14
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【答案】應(yīng)助回帖
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細(xì)菌基因組DNA的制備 一、材料 細(xì)菌培養(yǎng)物。 二、設(shè)備 移液管, 高速冷凍離心機(jī), 臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋。 三、試劑 1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。 四、操作步驟： 1. 100ml 細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。 2. 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37℃保溫1小時(shí)。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。 4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65℃保溫20分鐘。 5. 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。 6. 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。 7. 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。 8. 用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀無(wú)法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。 9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。 來(lái)自：百博明創(chuàng)（北京） |
5樓2013-10-16 09:52:09
971435258
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6樓2014-11-16 09:44:27
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