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靜安jingan鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
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[求助]
酵母平板
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| 剛做了轉(zhuǎn)化，用的是畢赤酵母，涂板后3天長(zhǎng)出來(lái)的菌落so奇怪，以至于我就不淡定了，平板是倒置的，結(jié)果菌落是細(xì)絲狀的垂直于平板生長(zhǎng)，也是白色的，當(dāng)然平板上也有那種很保守形態(tài)的酵母菌落，目前就是想知道這種到底是不是酵母，這個(gè)平板上的單克隆能不能用呢 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-10-08 16:00:24
靜安jingan: 金幣+8 2013-10-09 09:32:32
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靜安jingan: 金幣+8 2013-10-09 09:32:32
| 個(gè)人認(rèn)為，首先應(yīng)該確認(rèn)平板上其他單克隆菌落的形態(tài)是否為酵母的典型形態(tài)（如菌落飽滿、圓潤(rùn)、乳白色），是否有酵母特有的氣味。確認(rèn)確實(shí)如此之后，建議樓主進(jìn)行高拷貝篩選，并進(jìn)行PCR鑒定，這樣就確保篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，而且如能篩選到高拷貝轉(zhuǎn)化子在理論上能顯著提高表達(dá)量，對(duì)后續(xù)的表達(dá)純化非常有利。 |
2樓2013-10-08 14:48:02
靜安jingan
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
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怎么搞拷貝篩選啊，第一次聽(tīng)說(shuō)。 我剛剛才想到一種可能性，我的抗生素會(huì)見(jiàn)光失效，所以是涂板的時(shí)候提前涂上去的，先涂抗生素，再涂轉(zhuǎn)化后的菌液，在涂的時(shí)候可能會(huì)某種原因，使菌液在抗生素下層，所以可以生長(zhǎng)，到抗生素那層的時(shí)候由于沒(méi)有抗性，外圍的就沒(méi)有長(zhǎng)起來(lái)，但是內(nèi)部沒(méi)有直接接觸抗生素，所以可以生長(zhǎng)，所以就形成了這種古怪的形態(tài)。估計(jì)假陽(yáng)性的可能大。 早上涂片看了一下，都是酵母菌，唯一的區(qū)別就是普通菌落大部分處于生長(zhǎng)期，分裂的很少；而菌落形狀奇怪的則大部分處于分裂期 |
3樓2013-10-08 14:54:12
ndsc
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4樓2013-10-08 17:57:20
cuicchao
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5樓2013-10-08 22:30:00
【答案】應(yīng)助回帖
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靜安jingan: 金幣+7, ★★★很有幫助 2013-10-09 09:33:24
靜安jingan: 金幣+7, ★★★很有幫助 2013-10-09 09:33:24
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高拷貝篩選就是利用抗生素進(jìn)行梯度篩選。pPIC3.5K/pPIC9K等載體用G418梯度平板篩選，pPICZα系列的載體用博來(lái)霉素（Zeocin）篩選，根據(jù)樓主的描述所用抗生素會(huì)見(jiàn)光分解，那么猜測(cè)樓主所用的抗生素應(yīng)該是Zeocin。方法是先將所有的轉(zhuǎn)化子在96孔板上連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)三次，每次培養(yǎng)1-2天，使菌體濃度漸趨一致，在分別點(diǎn)接于不同抗生素濃度的平板上（取1ul），濃度梯度可以設(shè)置為：0,0.25,0.5,1.0,2.0mg/ml。然后挑選在最高抗生素濃度平板上生長(zhǎng)的菌落，培養(yǎng)后提取基因組利用AOX1通用引物或AOX1 3‘下游引物和α-factor組合引物或者是用目的基因特異性引物鑒定篩選到的轉(zhuǎn)化子。 |
6樓2013-10-09 08:24:40
靜安jingan
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