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WB結(jié)果膜總是黑成一片是怎么回事 已有1人參與
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做WB整整有一個(gè)月了，結(jié)果都不好，主要是條帶顏色淡，背景顏色深，有時(shí)甚至是整個(gè)黑成一片，根本看不到條帶的影子，很是惱火。有嘗試過換封閉液，增加封閉時(shí)間，增加洗膜次數(shù)，可結(jié)果依舊不好�，F(xiàn)在的條件是5%的脫脂奶粉（光明），一抗孵育過夜，洗膜（TBST：Nacl 8.8g,1M PH7.5 Tris HCL 20ml，Tween 20 1ml,蒸餾水定容至1L）5min*5次，二抗孵育1h，請(qǐng)教給位大神，我的問題到底出在哪兒,是操作中還是真的是抗體不行呢？ 2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg 2.jpg 2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg 2.jpg |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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6樓2013-10-23 21:17:57
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15樓2013-10-26 15:25:31
wodexinqin
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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16樓2013-10-26 19:37:54
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2樓2013-10-23 10:19:39
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3樓2013-10-23 10:19:53
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+5, 專家考核, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-10-24 00:29:33
民愛橋: 金幣+10, ★有幫助 2013-10-24 16:09:55
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背景太高了，原因與解決方法： 1.封閉不充分。延長封閉時(shí)間，更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）。 2. 一抗?jié)舛冗^高 。增加一抗稀釋倍數(shù)。 3.抗體孵育溫度過高。4℃孵育。 4.二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)。設(shè)置二抗對(duì)照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?。 5.一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng)。 在孵育和洗滌液中加入 Tween-20 以減少交叉反應(yīng)。 6.洗膜不充分。增加洗滌次數(shù)。 7.膜不合適。NC 膜比 PVDF 膜背景低。 8.膜干燥。保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。 |
4樓2013-10-23 11:13:01
茉莉夢(mèng)夢(mèng)
鐵蟲 (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
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民愛橋: 金幣+10 2013-10-24 16:10:49
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我也是才開始做wb，共勉。 你們實(shí)驗(yàn)室有其他人做么？看看師兄師姐的情況，有的時(shí)候某一批配的試劑有問題大家都會(huì)出現(xiàn)類似的問題，否則就是自己實(shí)驗(yàn)要改進(jìn)啦。 1、背景顏色深可能是封閉的問題，我因?yàn)槊看巫龅酵砩喜呸D(zhuǎn)完膜，所以都是4度封閉過夜，這樣反而背景比較淺。 還有壓片壓的時(shí)間短背景也會(huì)比較淺，但那需要條帶很深。 2、條帶淺可能是轉(zhuǎn)膜沒轉(zhuǎn)好，一抗、二抗沒有孵好。我們是一抗2.5h,二抗1.5h.如果發(fā)光液好的話，條帶很深，只壓一會(huì)就有正好的條帶而且背景比較淺。 （我壓時(shí)間長的片子背景都會(huì)有點(diǎn)深） |
5樓2013-10-23 11:45:01
jukongka
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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7樓2013-10-24 10:37:50
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