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WB結果膜總是黑成一片是怎么回事 已有1人參與
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做WB整整有一個月了，結果都不好，主要是條帶顏色淡，背景顏色深，有時甚至是整個黑成一片，根本看不到條帶的影子，很是惱火。有嘗試過換封閉液，增加封閉時間，增加洗膜次數(shù)，可結果依舊不好。現(xiàn)在的條件是5%的脫脂奶粉（光明），一抗孵育過夜，洗膜（TBST：Nacl 8.8g,1M PH7.5 Tris HCL 20ml，Tween 20 1ml,蒸餾水定容至1L）5min*5次，二抗孵育1h，請教給位大神，我的問題到底出在哪兒,是操作中還是真的是抗體不行呢？ 2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg 2.jpg 2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg 2.jpg |
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6樓2013-10-23 21:17:57
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15樓2013-10-26 15:25:31
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【答案】應助回帖
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民愛橋: 金幣+10, ★有幫助 2013-10-24 16:09:55
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背景太高了，原因與解決方法： 1.封閉不充分。延長封閉時間，更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）。 2. 一抗?jié)舛冗^高 。增加一抗稀釋倍數(shù)。 3.抗體孵育溫度過高。4℃孵育。 4.二抗非特異性結合或與封閉劑交叉反應。設置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?。 5.一抗或二抗與封閉劑有交叉反應。 在孵育和洗滌液中加入 Tween-20 以減少交叉反應。 6.洗膜不充分。增加洗滌次數(shù)。 7.膜不合適。NC 膜比 PVDF 膜背景低。 8.膜干燥。保證充分的反應液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。 |
4樓2013-10-23 11:13:01
【答案】應助回帖
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民愛橋: 金幣+10 2013-10-24 16:10:49
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我也是才開始做wb，共勉。 你們實驗室有其他人做么？看看師兄師姐的情況，有的時候某一批配的試劑有問題大家都會出現(xiàn)類似的問題，否則就是自己實驗要改進啦。 1、背景顏色深可能是封閉的問題，我因為每次做到晚上才轉(zhuǎn)完膜，所以都是4度封閉過夜，這樣反而背景比較淺。 還有壓片壓的時間短背景也會比較淺，但那需要條帶很深。 2、條帶淺可能是轉(zhuǎn)膜沒轉(zhuǎn)好，一抗、二抗沒有孵好。我們是一抗2.5h,二抗1.5h.如果發(fā)光液好的話，條帶很深，只壓一會就有正好的條帶而且背景比較淺。 （我壓時間長的片子背景都會有點深） |
5樓2013-10-23 11:45:01
jukongka
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