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WB結(jié)果膜總是黑成一片是怎么回事 已有1人參與
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做WB整整有一個(gè)月了，結(jié)果都不好，主要是條帶顏色淡，背景顏色深，有時(shí)甚至是整個(gè)黑成一片，根本看不到條帶的影子，很是惱火。有嘗試過換封閉液，增加封閉時(shí)間，增加洗膜次數(shù)，可結(jié)果依舊不好�，F(xiàn)在的條件是5%的脫脂奶粉（光明），一抗孵育過夜，洗膜（TBST：Nacl 8.8g,1M PH7.5 Tris HCL 20ml，Tween 20 1ml,蒸餾水定容至1L）5min*5次，二抗孵育1h，請(qǐng)教給位大神，我的問題到底出在哪兒,是操作中還是真的是抗體不行呢？ 2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg 2.jpg 2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg 2.jpg |
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9樓2013-10-24 16:09:14
niushuaiji
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2樓2013-10-23 10:19:39
ericyo918
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3樓2013-10-23 10:19:53
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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背景太高了，原因與解決方法： 1.封閉不充分。延長(zhǎng)封閉時(shí)間，更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）。 2. 一抗?jié)舛冗^高 。增加一抗稀釋倍數(shù)。 3.抗體孵育溫度過高。4℃孵育。 4.二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)。設(shè)置二抗對(duì)照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?。 5.一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng)。 在孵育和洗滌液中加入 Tween-20 以減少交叉反應(yīng)。 6.洗膜不充分。增加洗滌次數(shù)。 7.膜不合適。NC 膜比 PVDF 膜背景低。 8.膜干燥。保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。 |
4樓2013-10-23 11:13:01
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