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[求助] WB上樣量不同導(dǎo)致結(jié)果不同，哪一次的結(jié)果可信呢？

最近幾次WB做下來(lái)目的蛋白control和給藥組都沒(méi)有差異（條帶清晰，蛋白內(nèi)參顏色稍淡）。然后有老師建議減少上樣量。說(shuō)上樣量太大，抗體飽和后可能導(dǎo)致怎么做都沒(méi)有差異。于是我降低上樣量做了一次，果然又有差異了。正好另外一個(gè)師姐在做其他蛋白，因?yàn)槲宜龅哪康牡鞍邹D(zhuǎn)膜后也在她那張膜上。她和我用的是同一批樣品。所以我就請(qǐng)她把那張膜剪開(kāi)，順便把我要做的膜也孵上了抗體看看。然后她的上樣量介于我第一次和第二次之間�？贵w濃度比第一次降低了一些。做出來(lái)結(jié)果又沒(méi)有差異了。我被搞暈了。到底哪一次的結(jié)果才可信��？而且條帶都比較清楚。而有差異的也是比較明顯的那種。你們遇到這種情況怎么辦呢？重復(fù)幾次？要是每次重復(fù)結(jié)果都不一樣那又怎么辦呢？

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1樓 2013-11-08 10:56:01

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yipan

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【答案】應(yīng)助回帖

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你是自己配膠還是買的成品預(yù)制膠？成品預(yù)制膠沒(méi)有重復(fù)性差異，自己配膠的話多少會(huì)出現(xiàn)差異性。另外MARK標(biāo)記每次應(yīng)固定在一個(gè)位置，方便對(duì)照。上樣量可以多重復(fù)幾次，多做幾個(gè)批次，如果時(shí)間和樣本足夠的話。這樣就可以得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

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2樓2013-11-08 14:19:54

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cicelyzh

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【答案】應(yīng)助回帖

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一定濃度的抗體（任何稀釋度下）都有其線性工作范圍，超過(guò)這個(gè)范圍的信號(hào)可能飽和或者衰減很快甚至無(wú)法檢測(cè)到。所以，你需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品或者對(duì)照樣品的不同上樣量跑膠做WB。你給藥組的樣品的信號(hào)強(qiáng)度需要落在你檢測(cè)線性范圍內(nèi)。然后根據(jù)對(duì)照組或者標(biāo)準(zhǔn)品做的線性梯度來(lái)估算給藥組的蛋白表達(dá)量。

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3樓2013-11-09 09:27:31

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3樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-09 09:27:31
一定濃度的抗體（任何稀釋度下）都有其線性工作范圍，超過(guò)這個(gè)范圍的信號(hào)可能飽和或者衰減很快甚至無(wú)法檢測(cè)到。所以，你需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品或者對(duì)照樣品的不同上樣量跑膠做WB。你給藥組的樣品的信號(hào)強(qiáng)度需要落在你檢測(cè)線性 ...

那可以說(shuō)我做出來(lái)有差異那次的是可信的嗎？因?yàn)?次里我做的那次上樣量是最小的。而抗體濃度和第一次一樣，又比第二次高。可不可以這樣認(rèn)為呢（當(dāng)然還需要再次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）？另外，如果我那次的條件做出來(lái)結(jié)果是有差異的，那我是不是就可以不用再做線性梯度了？謝謝！

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4樓2013-11-11 09:17:57

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你用別的費(fèi)WB蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方法檢測(cè)一下，看看與那一次WB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。最簡(jiǎn)單的方法：免疫共沉淀,pull down.

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5樓2013-11-11 10:26:26

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cicelyzh

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★
herjasmine: 金幣+5, ★★★★★最佳答案, 很好！ 2013-11-12 09:25:06

引用回帖:

4樓: Originally posted by herjasmine at 2013-11-11 09:17:57
那可以說(shuō)我做出來(lái)有差異那次的是可信的嗎？因?yàn)?次里我做的那次上樣量是最小的。而抗體濃度和第一次一樣，又比第二次高�？刹豢梢赃@樣認(rèn)為呢（當(dāng)然還需要再次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）？另外，如果我那次的條件做出來(lái)結(jié)果是有差異 ...

如果你打算用western的暴光灰度來(lái)說(shuō)明表達(dá)量的多少，就需要做線性梯度，這是做western用于半定量檢測(cè)蛋白量的基本原理。也便于你做生物重復(fù)后的均值和誤差處理。

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6樓2013-11-11 10:30:54

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6樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-11 10:30:54
如果你打算用western的暴光灰度來(lái)說(shuō)明表達(dá)量的多少，就需要做線性梯度，這是做western用于半定量檢測(cè)蛋白量的基本原理。也便于你做生物重復(fù)后的均值和誤差處理。...

做線性梯度是什么意思啊?我做WB的時(shí)候遇到了和樓主相似的問(wèn)題，同一個(gè)的樣，做出來(lái)的結(jié)果卻不一樣，第一次做目的蛋白幾乎沒(méi)變化，第二次做目的蛋白上升，條件幾乎沒(méi)變，抗體重復(fù)使用，結(jié)果重復(fù)性不高，我經(jīng)常遇到這樣的情況，不知道為什么。

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7樓2015-05-29 15:59:22

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