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夢涵angle鐵蟲 (初入文壇)
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求去掉環(huán)狀質(zhì)粒中酶切位點和切后的質(zhì)粒連接問題？
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| 我想切掉質(zhì)粒上salI 與HindIII之間的一個酶切位點，選這兩種酶作為酶切點，切完后具體如何使用T4聚合酶或者Klenow Fragment使末端平滑化？如何再使切好的質(zhì)粒再連成環(huán)狀？ 第一次發(fā)帖，有點激動，可能說的不是很明白，求解！謝謝各位啊！ |
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 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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gyesang
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2013-11-08 23:12:53
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| 應(yīng)該還要看你用哪個公司的酶來選擇失活溫度吧。一般TOYOBO的HindIII需要在90度5分鐘才能使酶的殘余活性為0.還有雙切的時候如果不是用諸如Fermentas公司的fast digest buffer的話，對于HindIII，我的經(jīng)驗是最好酶切時間更長一點，我之前做都是20h。我的步驟是：20h雙酶切完畢后酶失活5分鐘，跑電泳切膠回收質(zhì)粒（這樣可以把salI和HindIII中間切下來的小片段去除），你把它再連成環(huán)狀需要用到T4連接酶，不過你沒有提到目的基因，一般目的基因應(yīng)該是一段兩端帶salI和HindIII酶切序列的PCR擴增片段（即insert），計算好insert和vector的mol比大概在3:1，體系總DNA量最好在10-100ng，整個體系總量20μl，不足的用水補足，在室溫下（23-26度）連接1個小時左右，再用乙醇沉淀法去除雜質(zhì)得到你需要的plasmid，不知道能不能幫到你。 |
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夢涵angle6樓2013-11-08 22:25:03
gyesang
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夢涵angle
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