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wumiaolemon新蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白質(zhì)-瓊脂糖電泳技術(shù)
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| 請問一下誰有蛋白質(zhì)-瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)步驟啊，包括各種試劑和配方方法，我們本來要做SDS-Page,但是老師說是試劑毒性比較大，換成瓊脂-蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)，三十找不到方法，求各位高手指導(dǎo) |
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myprayer
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不知道你說的蛋白質(zhì)具體指什么，這里給你提供的是血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳。 將血清脂蛋白用脂類染料(如蘇丹黑或油紅O等)進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行電泳分離。通電后，脂蛋白向正極移動，并分離為幾個區(qū)帶。 原 理 將血清脂蛋白用脂類染料(如蘇丹黑或油紅O等)進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行電泳分離。通電后，脂蛋白向正極移動，并分離為幾個區(qū)帶。 操 作 1．預(yù)染血清：血清0.2ml加蘇丹黑染色液0.2ml于小試管中，混合后置37℃水浴染色30分鐘，然后離心(2000轉(zhuǎn)/分，約5分鐘)。 2．制備瓊脂糖凝膠板：將已配制的0.45%瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化，用吸管吸取凝膠溶液澆注載玻片，每片2.5ml，靜置約半小時后凝固(天熱時需延長，可放冰箱數(shù)分鐘加速凝固)。 3．點(diǎn)加血清：已凝固的瓊脂糖凝膠板的一端約2cm處，用切口刀片垂直切入凝膠后立即取出，然后用銅絲小匙將長方小條凝膠取出。以小片濾紙吸干小槽中水分，用血色素吸管吸取經(jīng)過預(yù)染的血清約15μl，注入凝膠板上的小槽內(nèi)。 4．電泳：將加過血清的凝膠板平行放入電泳槽中，樣品應(yīng)在陰極一端。兩塊三層紗布于巴比妥緩沖液中浸潤，然后輕輕緊密貼在凝膠板兩端，紗布的另一端浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液(注意：此電極緩沖液不能用三羥甲烷緩沖液代替)。接通電源，電壓為120~130V，每片電流為3~4mA。約經(jīng)電泳15至55分鐘，即可見分離之色帶。 注意事項(xiàng) 1．電泳樣品要求為新鮮的空腹血清。 2．每一塊凝膠上可平行挖兩條小槽，因而可加兩個樣品。 3．如果用一形狀大小和小槽一樣的有機(jī)玻璃片，在瓊脂糖膠凝固前固定于適當(dāng)位子上，當(dāng)凝固后取出有機(jī)玻璃片，凝膠板上留下小槽可直接加樣，不需挖槽。 4．如果需要保留電泳樣本，可將電泳后之凝膠板(連同玻片)放于清水中浸泡脫鹽2小時，然后放烘箱(80℃左右)烘干即可。 試劑與器材 1．巴比緩沖液(pH8.6，離子強(qiáng)度0.075)：為電極緩沖液 巴比妥鈉15.4g，巴比妥2.76g，EDTA酸0.292g，加水溶解后加水至1000ml 2．三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.6)為凝膠緩沖液 三甲基氨基甲烷1.212g，EDTA酸0.29g，NaCl 15.85g加水溶解后加水至1000ml 3．瓊脂糖凝膠 瓊脂糖0.45g，三痙甲基氨基甲烷緩沖液50ml，水50ml 加熱至沸，待瓊脂糖溶解后立即停止加熱。 4．挖槽工具制作 切口刀：刀口長15mm的刀片，中央夾一有機(jī)玻璃或木片，用螺絲固定，使兩刀片相距1.5mm。挖槽小匙：用直徑1.5mm的銅絲約6cm長，一端錘成扁平，用砂紙磨光。 5．電泳槽和電泳儀：同血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的儀器。 |
2樓2013-11-16 14:10:35
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