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小二丫結(jié)婚金蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌基因工程菌表達(dá)的L-門(mén)冬酰胺酶純化及酶活測(cè)定方法，求指點(diǎn)！ 已有1人參與
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| 本人構(gòu)建了一株大腸桿菌基因工程菌，誘導(dǎo)后用于發(fā)酵產(chǎn)L-門(mén)冬酰胺酶（原設(shè)計(jì)是胞外表達(dá)），我是直接將發(fā)酵液掛Ni柱子純化蛋白（有組氨酸標(biāo)簽），用誘導(dǎo)前發(fā)酵液、誘導(dǎo)后發(fā)酵液、純化的目的蛋白同時(shí)跑電泳，結(jié)果沒(méi)看到目的蛋白分子量大小的條帶。還有，將發(fā)酵液離心后的上清液和菌體洗滌后懸浮再破壁的溶液同時(shí)測(cè)酶活（奈斯勒試劑顯色法：1ml0.04M的天冬酰胺底物加1ml0.02MpH=8的磷酸鹽緩沖液，37度水浴5min預(yù)熱后，加入粗酶液500ul37度反應(yīng)15min后，加入1ml50%的三氯乙酸終止反應(yīng)。再?gòu)慕K止管里取500ul加到3.5ml蒸餾水中，加入1ml奈斯勒試劑顯色15min，500nm處測(cè)OD值），結(jié)果值很低；在測(cè)OD值之前我將渾濁的反應(yīng)液都離心過(guò)了，加入奈斯勒試劑后明明看到顏色變得深黃，然后測(cè)OD值時(shí)卻顯示很低，實(shí)在不知道原因。請(qǐng)各位高手給點(diǎn)建議~~~謝謝 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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只說(shuō)酶活測(cè)定方法，我個(gè)人的理解： 1. 粗酶液里面有沒(méi)有含氮有機(jī)物啊，菇?jīng)瞿阌心居凶隹瞻讓?duì)照啊(是酶樣自己的空白對(duì)照，不是標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照)，就是先加三氯乙酸，然后水浴15min，水浴結(jié)束后再加粗酶液。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照問(wèn)題，硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品濃度多少，A500多少？與酶樣A500相比怎么樣？ 3. 酶活定義問(wèn)題，菇?jīng)瞿闶侨绾味x酶活的 (比如可以定義1min生成1μmole氨定義為1U)？理論上根據(jù)硫酸氨標(biāo)準(zhǔn)品濃度和門(mén)冬酰胺酶反應(yīng)時(shí)間， 可以計(jì)算出硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品代表多少酶活的，這樣才能計(jì)算你粗酶液的酶活，粗酶液A500低不代表酶活低 4. 奈斯勒試劑是自己配的還是買的碘化汞鉀？建議你在測(cè)定時(shí)候看看A500穩(wěn)定不穩(wěn)定，如果用碘化汞鉀的話，讀數(shù)有可能是不太穩(wěn)定的。 這個(gè)是中國(guó)藥典里面的門(mén)冬酰胺酶酶活測(cè)定方法： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6333558&fpage=1 |
4樓2013-12-10 19:51:27
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2樓2013-12-09 12:37:31
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3樓2013-12-09 15:07:44
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送紅花一朵 |
首先，粗酶液空白對(duì)照做了。我用了近似藥典的方法，硫酸銨濃度是0.001mol/L，A450為0.247，我覺(jué)得這個(gè)值可以一直用，不用每次都測(cè)。酶活定義：一個(gè)門(mén)冬酰胺酶單位相當(dāng)于每分鐘分解門(mén)冬酰胺產(chǎn)生1umoL氨所需的酶量。用藥典里的公式帶進(jìn)去算，數(shù)值是很低的。奈斯勒試劑是我自己配的，現(xiàn)配現(xiàn)用，讀數(shù)時(shí)不太穩(wěn)定，剛開(kāi)始我以為是機(jī)器的問(wèn)題，后來(lái)發(fā)現(xiàn)別的機(jī)器也一樣數(shù)據(jù)混亂。本身吸光度法就不太靠譜，現(xiàn)在每次測(cè)得數(shù)據(jù)都不一樣，徹底不知道酶活是多少了。。。。 |
5樓2013-12-11 10:43:42
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