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小二丫結(jié)婚

金蟲 (初入文壇)

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[求助] 大腸桿菌基因工程菌表達的L-門冬酰胺酶純化及酶活測定方法，求指點！已有1人參與

本人構(gòu)建了一株大腸桿菌基因工程菌，誘導(dǎo)后用于發(fā)酵產(chǎn)L-門冬酰胺酶（原設(shè)計是胞外表達），我是直接將發(fā)酵液掛Ni柱子純化蛋白（有組氨酸標簽），用誘導(dǎo)前發(fā)酵液、誘導(dǎo)后發(fā)酵液、純化的目的蛋白同時跑電泳，結(jié)果沒看到目的蛋白分子量大小的條帶。還有，將發(fā)酵液離心后的上清液和菌體洗滌后懸浮再破壁的溶液同時測酶活（奈斯勒試劑顯色法：1ml0.04M的天冬酰胺底物加1ml0.02MpH=8的磷酸鹽緩沖液，37度水浴5min預(yù)熱后，加入粗酶液500ul37度反應(yīng)15min后，加入1ml50%的三氯乙酸終止反應(yīng)。再從終止管里取500ul加到3.5ml蒸餾水中，加入1ml奈斯勒試劑顯色15min，500nm處測OD值），結(jié)果值很低；在測OD值之前我將渾濁的反應(yīng)液都離心過了，加入奈斯勒試劑后明明看到顏色變得深黃，然后測OD值時卻顯示很低，實在不知道原因。請各位高手給點建議~~~謝謝

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人生若只如初見，何事秋風悲畫扇。

1樓 2013-11-20 13:12:57

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xdfy0301

新蟲 (初入文壇)

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【答案】應(yīng)助回帖

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137167741: 金幣+1, 小木蟲交流，共同進步~~ 2014-01-19 08:52:43

對照樣品顏色怎么樣？可能本來酶活就低或者標準曲線太大不在最適范圍，低酶活對應(yīng)的吸光值低

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2樓2013-12-09 12:37:31

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ruoqiu.xiao

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引用回帖:

7樓: Originally posted by 小二丫結(jié)婚 at 2013-12-13 15:30:40
大仙問到我心坎上了，我自問數(shù)理化一塌糊涂（表問我為什么這個水平還搞科研，還研究生畢業(yè)了。。。）我確實是搞不清楚公式數(shù)理關(guān)系，也推算不出來，所以想走捷徑讓大仙們告訴我答案的，結(jié)果還是。。。沒弄懂。很感 ...

好吧，看在兩朵紅花的份兒上，給菇?jīng)鍪痉兑槐槿绾瓮频?img src="https://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/tiger/18.gif" align="absmiddle" border="0">，如果菇?jīng)鲆梦覍嵺`，我是不會拒絕滴

硫酸銨標準品濃度為0.001M，那么銨離子濃度為0.002M。
在顯色反應(yīng)中，菇?jīng)鰪慕K止管里取了0.5mL酶水解體系，那么我猜菇?jīng)黾恿蛩徜@標準品的時候應(yīng)該也是0.5mL，基于該假設(shè)，
標準品顯色反應(yīng)中，銨離子物質(zhì)的量應(yīng)該為：
n(ammonia)=2*10^-3 mole/L*0.5*10^-3 L=1*10^-6 mole=1μmole。
我們再假設(shè)，菇?jīng)瞿愕拿杆怏w系中門冬酰胺酶的濃度恰到好處，以至于從終止管里取出來的0.5mL酶水解體系中也含有1μmole銨，那么在15min的水解反應(yīng)時間內(nèi)，平均每min生成的銨的物質(zhì)的量，或者說水解速率，應(yīng)改為：
Hydrolysis velocity = 1μmole/15min=(1/15) μmole/min
注意水解速率單位是μmole/min，這恰恰也是酶活單位(通常1個單位酶活就是1U)，也就是說，水解速率就是酶活，所以，
Asparaginase activity= Hydrolysis velocity=(1/15) μmole/min =(1/15) U (注：通常1個單位酶活就是1U)。
也就是說，從終止管里取出來的0.5mL酶水解體系中含有(1/15) U的門冬酰胺酶，而終止管里原來有3.5mL，所以，終止管里總共含有(7/15) U的門冬酰胺酶。
最開始，菇?jīng)瞿阆蚪K止管里加入了0.5mL粗酶液，那么，
粗酶液的酶活應(yīng)該為(7/15) U / 0.5ml = (14/15) U/mL。
也就是說，如果菇?jīng)瞿愕拇置敢好富顬?14/15) U/mL，那么顯色反應(yīng)后的讀數(shù)應(yīng)該與0.001M硫酸銨標準品顯色反應(yīng)后的讀數(shù)是一樣的，也就是說，
0.001M硫酸銨標準品代表(14/15) U/mL的粗酶液。

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8樓2013-12-13 20:50:19

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