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小二丫結婚金蟲 (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌基因工程菌表達的L-門冬酰胺酶純化及酶活測定方法，求指點！ 已有1人參與
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| 本人構建了一株大腸桿菌基因工程菌，誘導后用于發(fā)酵產(chǎn)L-門冬酰胺酶（原設計是胞外表達），我是直接將發(fā)酵液掛Ni柱子純化蛋白（有組氨酸標簽），用誘導前發(fā)酵液、誘導后發(fā)酵液、純化的目的蛋白同時跑電泳，結果沒看到目的蛋白分子量大小的條帶。還有，將發(fā)酵液離心后的上清液和菌體洗滌后懸浮再破壁的溶液同時測酶活（奈斯勒試劑顯色法：1ml0.04M的天冬酰胺底物加1ml0.02MpH=8的磷酸鹽緩沖液，37度水浴5min預熱后，加入粗酶液500ul37度反應15min后，加入1ml50%的三氯乙酸終止反應。再從終止管里取500ul加到3.5ml蒸餾水中，加入1ml奈斯勒試劑顯色15min，500nm處測OD值），結果值很低；在測OD值之前我將渾濁的反應液都離心過了，加入奈斯勒試劑后明明看到顏色變得深黃，然后測OD值時卻顯示很低，實在不知道原因。請各位高手給點建議~~~謝謝 |
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ruoqiu.xiao
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小二丫結婚: 金幣+10 2014-03-06 15:20:23
小二丫結婚: 金幣+10 2014-03-06 15:20:23
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1. 確定公式里面的倍數(shù)關系沒搞錯？如果你深信自己沒搞錯，能不能自己推導出來？能不能像推倒男朋友一樣熟練地推導公式？比如說，菇?jīng)瞿阒雷约号涞?.001M硫酸銨相當于多少單位的酶活嗎？ 2. 既然你都發(fā)現(xiàn)顯色反應不穩(wěn)定的問題了，那每次測酶活時候為什么不再測定標準品A500 (還是A450？)呢？每次測定數(shù)值肯定都會有變化的。 3. 我覺得顯色反應不穩(wěn)定沒多大關系，只要能夠保證酶樣和標準品同時加入奈斯勒試劑，或加入的先后時間間隔不大。如果菇?jīng)瞿隳茏龅皆诙虝r間內加完奈斯勒試劑，接下來在測定A500時候，可以每隔幾分鐘讀一次A500，當然也是在短時間內讀完(所以建議用酶標儀，不要用光度計)，然后用每次讀數(shù)分別去計算酶活，最后你會發(fā)現(xiàn)若干次酶活測定結果誤差其實不是很大。 |
6樓2013-12-11 15:35:27
xdfy0301
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2樓2013-12-09 12:37:31
小二丫結婚
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3樓2013-12-09 15:07:44
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【答案】應助回帖
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只說酶活測定方法，我個人的理解： 1. 粗酶液里面有沒有含氮有機物啊，菇?jīng)瞿阌心居凶隹瞻讓φ瞻?是酶樣自己的空白對照，不是標準品的對照)，就是先加三氯乙酸，然后水浴15min，水浴結束后再加粗酶液。 2. 標準品對照問題，硫酸銨標準品濃度多少，A500多少？與酶樣A500相比怎么樣？ 3. 酶活定義問題，菇?jīng)瞿闶侨绾味x酶活的 (比如可以定義1min生成1μmole氨定義為1U)？理論上根據(jù)硫酸氨標準品濃度和門冬酰胺酶反應時間， 可以計算出硫酸銨標準品代表多少酶活的，這樣才能計算你粗酶液的酶活，粗酶液A500低不代表酶活低 4. 奈斯勒試劑是自己配的還是買的碘化汞鉀？建議你在測定時候看看A500穩(wěn)定不穩(wěn)定，如果用碘化汞鉀的話，讀數(shù)有可能是不太穩(wěn)定的。 這個是中國藥典里面的門冬酰胺酶酶活測定方法： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6333558&fpage=1 |
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4樓2013-12-10 19:51:27
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