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小二丫結(jié)婚金蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌基因工程菌表達(dá)的L-門冬酰胺酶純化及酶活測(cè)定方法，求指點(diǎn)！ 已有1人參與
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| 本人構(gòu)建了一株大腸桿菌基因工程菌，誘導(dǎo)后用于發(fā)酵產(chǎn)L-門冬酰胺酶（原設(shè)計(jì)是胞外表達(dá)），我是直接將發(fā)酵液掛Ni柱子純化蛋白（有組氨酸標(biāo)簽），用誘導(dǎo)前發(fā)酵液、誘導(dǎo)后發(fā)酵液、純化的目的蛋白同時(shí)跑電泳，結(jié)果沒(méi)看到目的蛋白分子量大小的條帶。還有，將發(fā)酵液離心后的上清液和菌體洗滌后懸浮再破壁的溶液同時(shí)測(cè)酶活（奈斯勒試劑顯色法：1ml0.04M的天冬酰胺底物加1ml0.02MpH=8的磷酸鹽緩沖液，37度水浴5min預(yù)熱后，加入粗酶液500ul37度反應(yīng)15min后，加入1ml50%的三氯乙酸終止反應(yīng)。再?gòu)慕K止管里取500ul加到3.5ml蒸餾水中，加入1ml奈斯勒試劑顯色15min，500nm處測(cè)OD值），結(jié)果值很低；在測(cè)OD值之前我將渾濁的反應(yīng)液都離心過(guò)了，加入奈斯勒試劑后明明看到顏色變得深黃，然后測(cè)OD值時(shí)卻顯示很低，實(shí)在不知道原因。請(qǐng)各位高手給點(diǎn)建議~~~謝謝 |
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ruoqiu.xiao
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好吧，看在兩朵紅花的份兒上，給菇?jīng)鍪痉兑槐槿绾瓮频?img src="https://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/tiger/18.gif" align="absmiddle" border="0">，如果菇?jīng)鲆梦覍?shí)踐，我是不會(huì)拒絕滴  硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.001M，那么銨離子濃度為0.002M。 在顯色反應(yīng)中，菇?jīng)鰪慕K止管里取了0.5mL酶水解體系，那么我猜菇?jīng)黾恿蛩徜@標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)候應(yīng)該也是0.5mL，基于該假設(shè)， 標(biāo)準(zhǔn)品顯色反應(yīng)中，銨離子物質(zhì)的量應(yīng)該為： n(ammonia)=2*10^-3 mole/L*0.5*10^-3 L=1*10^-6 mole=1μmole。 我們?cè)偌僭O(shè)，菇?jīng)瞿愕拿杆怏w系中門冬酰胺酶的濃度恰到好處，以至于從終止管里取出來(lái)的0.5mL酶水解體系中也含有1μmole銨，那么在15min的水解反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，平均每min生成的銨的物質(zhì)的量，或者說(shuō)水解速率，應(yīng)改為： Hydrolysis velocity = 1μmole/15min=(1/15) μmole/min 注意水解速率單位是μmole/min，這恰恰也是酶活單位(通常1個(gè)單位酶活就是1U)，也就是說(shuō)，水解速率就是酶活，所以， Asparaginase activity= Hydrolysis velocity=(1/15) μmole/min =(1/15) U (注：通常1個(gè)單位酶活就是1U)。 也就是說(shuō)，從終止管里取出來(lái)的0.5mL酶水解體系中含有(1/15) U的門冬酰胺酶，而終止管里原來(lái)有3.5mL，所以，終止管里總共含有(7/15) U的門冬酰胺酶。 最開(kāi)始，菇?jīng)瞿阆蚪K止管里加入了0.5mL粗酶液，那么， 粗酶液的酶活應(yīng)該為(7/15) U / 0.5ml = (14/15) U/mL。 也就是說(shuō)，如果菇?jīng)瞿愕拇置敢好富顬?14/15) U/mL，那么顯色反應(yīng)后的讀數(shù)應(yīng)該與0.001M硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品顯色反應(yīng)后的讀數(shù)是一樣的，也就是說(shuō)， 0.001M硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品代表(14/15) U/mL的粗酶液。 求紅花  求推倒 各種求 |
8樓2013-12-13 20:50:19
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2樓2013-12-09 12:37:31
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3樓2013-12-09 15:07:44
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【答案】應(yīng)助回帖
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只說(shuō)酶活測(cè)定方法，我個(gè)人的理解： 1. 粗酶液里面有沒(méi)有含氮有機(jī)物啊，菇?jīng)瞿阌心居凶隹瞻讓?duì)照啊(是酶樣自己的空白對(duì)照，不是標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照)，就是先加三氯乙酸，然后水浴15min，水浴結(jié)束后再加粗酶液。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照問(wèn)題，硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品濃度多少，A500多少？與酶樣A500相比怎么樣？ 3. 酶活定義問(wèn)題，菇?jīng)瞿闶侨绾味x酶活的 (比如可以定義1min生成1μmole氨定義為1U)？理論上根據(jù)硫酸氨標(biāo)準(zhǔn)品濃度和門冬酰胺酶反應(yīng)時(shí)間， 可以計(jì)算出硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品代表多少酶活的，這樣才能計(jì)算你粗酶液的酶活，粗酶液A500低不代表酶活低 4. 奈斯勒試劑是自己配的還是買的碘化汞鉀？建議你在測(cè)定時(shí)候看看A500穩(wěn)定不穩(wěn)定，如果用碘化汞鉀的話，讀數(shù)有可能是不太穩(wěn)定的。 這個(gè)是中國(guó)藥典里面的門冬酰胺酶酶活測(cè)定方法： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6333558&fpage=1 |
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4樓2013-12-10 19:51:27
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