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[求助]
EMSA看不見任何帶，求助求助 已有1人參與
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最近在做EMSA,自己以前沒有做過啊，配置了以下試劑， Binding Buffer (store at -20℃) 10mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM DTT 0.2mM, 0.05% NP-40, 10% glycerol, pH 7.4 配置非變性聚丙烯酰胺凝膠(以6％濃度為例) 5×TBE 1mL 30％Ac-Bi 2mL 40％Glycerin 625μl DDW 3.125Ml 10%AP 150μl 10%TEMED 100μl 以預(yù)冷為4℃的0.5×TBE為電泳緩沖液，100V預(yù)電泳30-60min 我的DNA是單鏈，5‘FAM標(biāo)記，退火后加入Binding Buffer，細(xì)胞核蛋白孵育1h后加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上樣10－20μl，100V電泳至溴酚藍(lán)于三分之二處。 但是結(jié)果如下圖，沒有條帶，而后我又用不帶標(biāo)記的DNA與蛋白孵育以后進(jìn)行EMSA，然后用EB染膠，發(fā)現(xiàn)DNA都在加樣孔處，且呈現(xiàn)梯度增加（幾個(gè)孔所加DNA含量相等，但是細(xì)胞核蛋白梯度增加）。下圖由右至左：Marker,DNA,細(xì)胞核蛋白，之后的幾個(gè)孔都是DNA+細(xì)胞核蛋白，且細(xì)胞核蛋白濃度增加。 有一個(gè)奇怪的現(xiàn)象就是Marker的孔下方也會(huì)有亮亮的彎曲的條帶，不知道是什么東西？ 哪位大俠看看如何改進(jìn)？萬分感謝��！實(shí)驗(yàn)就差這最后的一個(gè)實(shí)驗(yàn)了。。。。 dell 2013-12-04 14 時(shí) 44 分.JPG dell 2013-12-04 14 時(shí) 42 分.JPG [ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:32 ] |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 實(shí)驗(yàn)求助 |
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yang0071
木蟲 (職業(yè)作家)
- 應(yīng)助: 207 (大學(xué)生)
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2樓2013-12-05 07:41:16
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8樓2021-09-29 21:30:09
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