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[求助]
EMSA看不見任何帶，求助求助 已有1人參與
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最近在做EMSA,自己以前沒有做過啊，配置了以下試劑， Binding Buffer (store at -20℃) 10mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM DTT 0.2mM, 0.05% NP-40, 10% glycerol, pH 7.4 配置非變性聚丙烯酰胺凝膠(以6％濃度為例) 5×TBE 1mL 30％Ac-Bi 2mL 40％Glycerin 625μl DDW 3.125Ml 10%AP 150μl 10%TEMED 100μl 以預(yù)冷為4℃的0.5×TBE為電泳緩沖液，100V預(yù)電泳30-60min 我的DNA是單鏈，5‘FAM標(biāo)記，退火后加入Binding Buffer，細(xì)胞核蛋白孵育1h后加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上樣10－20μl，100V電泳至溴酚藍(lán)于三分之二處。 但是結(jié)果如下圖，沒有條帶，而后我又用不帶標(biāo)記的DNA與蛋白孵育以后進(jìn)行EMSA，然后用EB染膠，發(fā)現(xiàn)DNA都在加樣孔處，且呈現(xiàn)梯度增加（幾個孔所加DNA含量相等，但是細(xì)胞核蛋白梯度增加）。下圖由右至左：Marker,DNA,細(xì)胞核蛋白，之后的幾個孔都是DNA+細(xì)胞核蛋白，且細(xì)胞核蛋白濃度增加。 有一個奇怪的現(xiàn)象就是Marker的孔下方也會有亮亮的彎曲的條帶，不知道是什么東西？ 哪位大俠看看如何改進(jìn)？萬分感謝��！實驗就差這最后的一個實驗了。。。。 dell 2013-12-04 14 時 44 分.JPG dell 2013-12-04 14 時 42 分.JPG [ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:32 ] |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 | 實驗求助 |
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3樓2013-12-05 09:36:16
yang0071
木蟲 (職業(yè)作家)
- 應(yīng)助: 207 (大學(xué)生)
- 金幣: 1573.4
- 散金: 9319
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- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
2樓2013-12-05 07:41:16
4樓2014-09-17 09:22:12
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5樓2014-11-07 23:06:40
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