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yangjingjing木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
RetroQ質(zhì)粒不同體系雙酶切，怎么會(huì)出現(xiàn)不同的帶？
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上圖左起Marker，RetroQ質(zhì)粒，20u雙l酶切體系（1ug質(zhì)粒），20ul雙酶切體系（1ug質(zhì)粒），50ul雙酶切體系（5ug）~~~條帶的周圍被我切的，不是傳說(shuō)中的雜帶， 20ul體系是一孔直接上樣，50ul體系的是分兩孔上樣的。為啥條帶不在同一位置呢？ 下圖左起Marker，RetroQ質(zhì)粒，20u雙l酶切體系（1ug質(zhì)粒），30ul雙酶切體系（1ug質(zhì)粒），50ul雙酶切體系（1ug）（分兩孔），50ul雙酶切體系（3ug）（分兩孔），50ul雙酶切體系（5ug）（分兩孔）~~~~切了5h 我用的酶切位點(diǎn)是BamH1和EcoR1（二者間隔5bp），TAKARA的酶。這個(gè)到底是啥子情況 ��？為啥位置還有差別呢？是沒(méi)有酶切完全？ 20,50qie.JPG 2013.12.7R,R20,R30,R50,R50-3,R50-5=5.JPG |
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yangjingjing
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7樓2013-12-12 20:19:19
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-12-11 09:58:40
yangjingjing: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2013-12-11 12:42:55
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| 你的情況明顯是因?yàn)槊盖胁煌耆蛘呋緵](méi)有切開(kāi)。從你第一張圖上的質(zhì)粒對(duì)照條帶位置基本與你50μl切5μg持平，說(shuō)明沒(méi)有切開(kāi)。做酶切建立反應(yīng)體系時(shí)質(zhì)粒的濃度不宜過(guò)高，一般是20μl體系里切1μg質(zhì)粒。如果體系建得太濃，質(zhì)粒的體積占總體積的比例會(huì)增加。在抽提質(zhì)粒的過(guò)程中往往會(huì)有一些鹽難以除干凈。有些酶對(duì)鹽濃度是比較敏感的。而且質(zhì)粒一般溶解在TE里，EDTA對(duì)酶切反應(yīng)有抑制。用50μl里切5μg質(zhì)粒有些多了，雖然多加酶或者延長(zhǎng)時(shí)間也可以達(dá)到完全切開(kāi)的效果。 |
2樓2013-12-11 09:24:04
yangjingjing
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4樓2013-12-11 13:28:17
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