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weiyuanzheng銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于點突變 已有3人參與
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各位大蝦，求助如下： 以各位大蝦做點突變的經(jīng)驗，ORF框內(nèi)除了target site突變，其它位置也有突變，這個一般是什么原因造成的？我用的是Takara的點突變試劑盒，目的片段在T載體上，總長3000多bp，在試劑盒要求的片段長度內(nèi)。而且發(fā)現(xiàn)點突變總是在非target site位置的TTT處少一個T堿基，這是為什么？謝謝啦 |
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gyesang
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4樓2013-12-26 14:53:35
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2樓2013-12-26 11:13:24
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3樓2013-12-26 11:15:41
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2013-12-26 15:44:22
weiyuanzheng: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-12-27 21:15:38
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weiyuanzheng: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-12-27 21:15:38
| takara的點突變試劑盒沒用過。。但是里面肯定會有PCR的步驟，你確認下你PCR的時候用的什么Taq酶？如果是rTaq的話P3000多的條帶延伸至少3分鐘以上，如果30個循環(huán)的話至少也要P個2——3個小時，循環(huán)到后期Taq酶的活性都不行了，突變概率自然成倍提高~~如果你想上T載體的話，可以把試劑盒里的rTaq（或者LATaq）換成ExTaq，或者直接用高保真的系列PCR完再向體系中加點rTaq和dNTP72度處理5分鐘給PCR產(chǎn)物加尾 |
5樓2013-12-26 15:23:52
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