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weiyuanzheng銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于點(diǎn)突變 已有3人參與
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各位大蝦，求助如下： 以各位大蝦做點(diǎn)突變的經(jīng)驗(yàn)，ORF框內(nèi)除了target site突變，其它位置也有突變，這個(gè)一般是什么原因造成的？我用的是Takara的點(diǎn)突變試劑盒，目的片段在T載體上，總長3000多bp，在試劑盒要求的片段長度內(nèi)。而且發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變總是在非target site位置的TTT處少一個(gè)T堿基，這是為什么？謝謝啦 |
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luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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weiyuanzheng: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-12-27 21:15:38
| takara的點(diǎn)突變試劑盒沒用過。。但是里面肯定會(huì)有PCR的步驟，你確認(rèn)下你PCR的時(shí)候用的什么Taq酶？如果是rTaq的話P3000多的條帶延伸至少3分鐘以上，如果30個(gè)循環(huán)的話至少也要P個(gè)2——3個(gè)小時(shí)，循環(huán)到后期Taq酶的活性都不行了，突變概率自然成倍提高~~如果你想上T載體的話，可以把試劑盒里的rTaq（或者LATaq）換成ExTaq，或者直接用高保真的系列PCR完再向體系中加點(diǎn)rTaq和dNTP72度處理5分鐘給PCR產(chǎn)物加尾 |
5樓2013-12-26 15:23:52
cicelyzh
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2樓2013-12-26 11:13:24
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4樓2013-12-26 14:53:35
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