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icenoreen銅蟲 (初入文壇)
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關(guān)于細(xì)胞遷移實驗transwell使用的一些操作問題 已有3人參與
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我最近要做某種蛋白的趨化性試驗，由于之前沒有做過，所以在實驗設(shè)計上查了不少資料，也參考了小木蟲上的挺多經(jīng)驗，自己做了個實驗設(shè)計，準(zhǔn)備這兩天做，但還有挺多細(xì)節(jié)不太明確，所以上來發(fā)一下我的實驗步驟和設(shè)計，請教大家一些細(xì)節(jié)上的問題，也和做過的網(wǎng)友們交流一下。 我買的是Corning#3422 transwell，用的細(xì)胞是SD大白鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞。 根據(jù)查得的資料（包括transwell說明書，corning官網(wǎng)的指南，網(wǎng)上下的操作說明以及論壇上的交流總結(jié)）我把實驗步驟簡單總結(jié)如下： 1. MSC鋪滿培養(yǎng)瓶底80%左右時，換無血清培基，饑餓處理24h�！敬颂幣嗷枰�0.5%BSA嗎？】 2. 胰酶消化細(xì)胞，用無血清培基（含0.5%BSA）中止消化并稀釋得細(xì)胞懸液（10萬/ml）。 3. 100ul細(xì)胞懸液接種至上室，600ul 10%FBS的培基加入下室�！具@個順序?qū)�？還是應(yīng)該先加下室？還是無所謂？】【干細(xì)胞的接種量多少比較合適？我這里是按照一般的24孔板用1萬/孔可以嗎？還有一般需要至少幾個平行孔？transwell孔板比較貴，在保證盡量準(zhǔn)確的情況下最少設(shè)2個平行樣行嗎？】 4. 孵育一定時間�！疚业母杉�(xì)胞在培養(yǎng)瓶里時一般4小時左右就能貼壁，8小時基本完全鋪展，那么做遷移測試的時候應(yīng)該放多長時間呢？】 5. 計數(shù)。 (1) 用棉簽擦去上室細(xì)胞�！具@里我很不明確啊，我下載的官網(wǎng)說明只說“除去上室細(xì)胞”，網(wǎng)上網(wǎng)友大多都說用棉簽擦掉，用的是一般的那種醫(yī)用棉簽？具體怎么擦？這樣擦對下室細(xì)胞沒影響么？】 (2) 染色用顯微鏡拍照和計數(shù)或MTT法測OD值計數(shù)�！臼遣皇羌�(xì)胞比較多的時候測OD值更準(zhǔn)確？如果我又想拍照又想測得比較準(zhǔn)又不想設(shè)置太多孔平行樣是不是可以用結(jié)晶紫染色后洗脫測一次OD值然后再次染色拍照？】 我的實驗設(shè)計： 預(yù)實驗：以不同接種數(shù)量和不同孵育時間試驗找到最優(yōu)條件。 實驗：無血清培基（含0.5%BSA）中加入不同濃度待測蛋白作為下室培基進(jìn)行實驗，測該蛋白的dose-dependence，無血清培基（含0.5%BSA）作為空白對照，10%FBS培基作為正對照。 以上是我的實驗設(shè)計，方括號里的是我的一些問題想請教大家......因為我還沒開始做所以問題有點(diǎn)多......有做過或者準(zhǔn)備做遷移實驗的人一起來交流一下吧！ P.S. 我本身是材料專業(yè)做生物材料的，跨學(xué)科很多生物的東西都還在學(xué)，如果有的問題比較低級的話還請大家見諒和耐心賜教呢  [ Last edited by icenoreen on 2013-12-30 at 19:44 ] |
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 細(xì)胞科學(xué) |
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自己頂上來，順便再問一個問題…… 我做了一次遷移實驗，用不同濃度百分比血清的培基來做的預(yù)實驗，遷移細(xì)胞數(shù)量梯度倒是挺明顯的，但染色以后顯微鏡下看發(fā)現(xiàn)細(xì)胞都在膜的邊緣一圈，中間一個細(xì)胞也沒有……不知道是為什么啊~ 我在想是不是我用棉簽擦上層細(xì)胞的時候太用力所以把中間細(xì)胞都抖下去了？ 還是往上室加細(xì)胞懸液了以后細(xì)胞傾向于往邊上貼壁？ 另外，誰能告訴我一下用棉簽擦去上層細(xì)胞的具體細(xì)節(jié)啊？網(wǎng)上完全搜不到關(guān)于這個的詳細(xì)說明，只有一句“用棉簽擦”，大家都覺得很好擦嗎？為什么我覺得很難擦啊，transwell上室就那么小，棉簽頭基本上剛好伸進(jìn)去，很難確保整個都擦到了呀...... 求教擦上室細(xì)胞的具體方法�。ㄓ妹藓灮蛘哂脛e的什么都可以，只要能除去上室細(xì)胞~） 再次不勝感激！ 回復(fù)的人好少好少...求交流呀>< |
4樓2014-01-02 20:26:38
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1.此處培基不需要加0.5%BSA。 2.我一般是先加上室，再加下室，不過我覺得這個無所謂。 3.每孔一萬個細(xì)胞是不是有點(diǎn)少啊，我用的腫瘤細(xì)胞都是十的五次方。平行孔，我一般設(shè)置兩組。 4.做遷移的時間就看你自己怎么設(shè)置了，24,48小時都可以，或者做的再細(xì)一些也行。 5.上室細(xì)胞就用醫(yī)用棉簽輕輕轉(zhuǎn)著擦掉就可以了，不會影響遷移過去的細(xì)胞。 |
2樓2013-12-31 11:14:20
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3樓2013-12-31 11:43:09
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5樓2014-01-13 21:47:02
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